酸性蛋白酶作为一种动物饲料添加剂,能够有效地提高动物胃部对氨基酸和小肽的吸收。目前,所有的工业级酸性蛋白酶都来源于曲霉属真菌,但其产量很低。本研究的目的就是通过甲基营养型酵母毕赤酵母得到高产量的酸性蛋白酶。本研究的主要结果如下：1.宇佐美曲霉酸性蛋白酶(PepA)的基因合成宇佐美曲霉酸性蛋白酶PepA基因由1182个碱基组成并编码394个氨基酸(其中有20个氨基酸编码信号肽序列,50个氨基酸编码前导肽,324个氨基酸编码成熟酶)。编码区在不改变氨基酸序列的前提下,根据毕赤酵母密码子的偏爱性进行优化并合成pepA。2. PepA表达载体的构建和表达PepA在毕赤酵母载体pHBM905A中成功地实现表达。重组酵母菌体命名为PEPASA,然而,其产量不高,即0.578mg/ml。于是,我们通过2种方法来提高PepA在毕赤酵母中的表达量。一种方法是构建新的毕赤酵母表达载体pHBM905BDM,它包括AOX启动子突变体和合成型信号肽(MF4I),实验数据表明与PepA在pHBM905A表达载体上产量相比,PepA在pHBM905BDM表达载体上产量仅仅提高了1%。另一种方法是运用体外构建多拷贝的方法选育出含有不同拷贝数的重组菌株。将带有1,2,3,4拷贝的酵母重组菌分别命名为PEPAS1, PEPAS2, PEPAS3, PEPAS4。结果显示随着拷贝数的增加,一拷贝菌株到三拷贝菌株的PepA产量呈递增趋势,当增加到四拷贝时,PepA的产量开始减少。菌株PEPAS1, PEPAS2, PEPAS3, PEPAS4的PepA产量分别为0.593mg/ml,0.669mg/ml,1.058mg/ml,0.975mg/ml。其结果与通过qRT-PCR分析各拷贝菌株中pepA基因在转录水平上mRNA的丰度趋势一致。三拷贝菌株PEPAS3在30L发酵罐中高密度发酵72小时后PepA产量达到4.3mg/ml。本研究中提高表达量的方法可以应用于其他重要的工业酶。3. PepA的纯化PepA通过硫酸铵沉淀法进行纯化,纯度提高了1.3倍,比活性为4127.3U/mg。通过SDS-PAGE电泳分析,相对于天然PepA的分子量大小44kDa,PepA在毕赤酵母中表达发生了糖基化其分子量大小为76kDa。宇佐美曲霉酸性蛋白酶PepA存在1个N糖基化的预测位点和3个0糖基化的预测位点。由于糖基化修饰提高了PepA的热稳性,从而进一步提高了其高拷贝菌株表达PepA的比活性。4.纯化后PepA的酶学性质该酶的最适PH值为2.5,最适温度为50℃。PMSF对宇佐美曲霉酸性蛋白酶的活性没有影响,所以该酶为天冬氨酸蛋白酶。Ca2+,Zn2+,Fe2+,NH4+对该酶有激活作用,而Cu2+,Co2+,Mg2+,Fe3+,SDS对该酶有抑制作用。