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目的：
慢性应激指机体在长期缓慢的外界环境及精神压力刺激下产生的一种生理及心理障碍。当今社会生活节奏日益加快，人们往往因社会压力、不良情志刺激而长期处于慢性应激的状态之下，使精神和社会因素引发的疾病日益增多，严重危害公共健康。其中，慢性应激已成为影响胃肠功能的重要病因之一[1]。前期从慢性应激致胃肠功能紊乱的脑肠肽变化、PFC-NAc-VTA神经环路变化，深入研究了中医肝郁犯胃发生机制，最新研究指出，慢性应激可致肠道功能紊乱的同时，可出现肠道菌群变化，并诱导肠黏膜NLRP3炎症小体变化。因此，本研究拟进一步从“慢性应激-肠道菌群-炎症小体”的角度，研究中医肝郁犯胃证的发生机制，并通过观察疏肝和胃汤的影响，研究疏肝和胃汤调节胃肠功能的作用机制。本研究可为中医药防治此类疾病提供重要的理论和实验依据。
方法：
1.理论研究：采用文献分析方法，整理古代医家对慢性应激相关病证病因相同或相似的记载，归纳慢性应激致胃肠功能紊乱相关病证因机证候；并梳理分析《伤寒杂病论》中论及情志应激影响胃肠症状的条文，揭示慢性应激致胃肠功能紊乱相关证候的辨治规律；通过整理肠道菌群紊乱诱导的肠黏膜NLRP3炎症小体变化的文献，分析中医肝郁犯胃的胃肠症状与慢性应激致胃肠功能紊乱相关病证的相关性，提出从慢性应激致胃肠功能紊乱的肠道菌群、NLRP3炎症小体角度进行中医肝郁犯胃的研究思路。
2.实验研究：①模型制作及评价：采用慢性不可预知性应激结合孤养法造模3 w，造模完成后给予低、高两种不同浓度疏肝和胃汤（生药量分别为0.56 g/ml、1.12 g/ml），四逆散（生药量为0.28 g/ml）及低聚果糖灌胃干预7 d，观察大鼠一般情况及体质量增长；运用糖水偏好实验、旷场实验、强迫游泳实验，进行行为学评价；对粪便性状进行Bristol评分与含水率比较，评估模型大鼠肠功能。
②盲肠组织病理学观察：采用苏木精-伊红染色（HE染色）观察盲肠黏膜形态改变及其病理学变化；
③肠道菌群的检测：运用16S rRNA高通量测序技术观察慢性应激模型大鼠盲肠菌群组成、比例及丰度。
④炎症小体相关指标的检测：运用酶联免疫吸附测定（ELISA法）检测血清中NLRP3炎性小体及其相关炎症因子的含量；运用聚合酶链式反应（RT-PCR法）测定盲肠黏膜组织炎症小体NLRP3、Caspase-1、ASC及相关炎症因子IL-1β、IL-18 mRNA的相对表达量；运用免疫荧光（IF法）观察盲肠组织NLRP3、Caspase-1、ASC及相关炎症因子IL-1β、IL-18的阳性表达。
3.肠道菌群与炎症小体相关性分析：对慢性不可预知性应激大鼠盲肠菌群中差异菌种与血清及盲肠黏膜部分炎症小体及相关炎症因子进行Spearman相关分析，并使用PICRUSt针对16S rRNA扩增子测序结果进行功能预测，进行菌群COG功能分类分析及KEGG pathway丰度统计。
结果：
1.理论研究：古代文献分析发现，慢性应激类似于中医病因学说的情志致病，情志致病以影响脏腑气机为主，其病位主要在肝，反复长期的精神刺激归属中医肝郁证范畴。因情志失调，肝失疏泄，脾胃升降反常，肠腑传导失职，可见慢性应激致胃肠功能紊乱的相关情志及胃肠症状，肝郁犯胃证是慢性应激致胃肠功能紊乱相关病证的主要证候之一，以疏肝和胃，调畅气机为治疗大法。
现代医学发现慢性应激会导致肠道菌群紊乱，而肠道菌群紊乱可诱导肠黏膜NLRP3炎症小体激活，导致胃肠功能失调。因此可以从肠道菌群紊乱诱导的肠黏膜NLRP3炎症小体变化为切入点，研究肝郁犯胃的发生机制及疏肝和胃汤的作用机制。
2.实验研究：
实验一：慢性应激模型大鼠体质量、行为学、肠功能的变化及疏肝和胃汤的影响
①模型组大鼠体质量增长量显著下降，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；疏肝和胃汤低、高剂量组及低聚果糖组体质量增长量均不同程度上升，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；其中，疏肝和胃汤低、高剂量组体质量上升明显，与低聚果糖组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），四逆散组与低聚果糖组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
②模型组糖水偏好率明显下降，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；疏肝和胃汤低、高剂量组，四逆散组及低聚果糖组糖水偏好率升高，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；其中，疏肝和胃汤各剂量组及四逆散组与低聚果糖组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
③模型组旷场实验运动总距离明显缩短，静止时间明显延长，穿越中央区域次数减少，与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；疏肝和胃汤低、高剂量组，四逆散组及低聚果糖组运动总距离延长，疏肝和胃汤低、高剂量组静止时间明显缩短，疏肝和胃汤高剂量组穿越中央区域次数增多，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；其中，疏肝和胃汤低、高剂量组静止时间缩短，与低聚果糖组比较差异有统计学意义（P＜0.01），而运动总距离及穿越中央区域次数与低聚果糖组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
④模型组强迫游泳实验不动时间明显延长，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；疏肝和胃汤低、高剂量组强迫游泳实验不动时间明显缩短，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；其中，疏肝和胃汤低、高剂量组强迫游泳实验不动时间明显缩短，与低聚果糖组比较差异有统计学意义（P＜0.01），而四逆散组与低聚果糖组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
⑤模型组大鼠粪便Bristol评分明显提高，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；疏肝和胃汤低、高剂量组，四逆散组及低聚果糖组粪便Bristol评分明显下降，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；其中，疏肝和胃汤低、高剂量组Bristol评分明显缩短，与低聚果糖组比较差异有统计学意义（P＜0.01），而四逆散组与低聚果糖组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
⑥模型组大鼠粪便含水率下降，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；疏肝和胃汤低、高剂量组，四逆散组及低聚果糖组粪便含水率明显上升，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；疏肝和胃汤低、高剂量组及四逆散组粪便含水率明显上升，与低聚果糖组比较差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。
实验二：慢性应激模型大鼠盲肠黏膜形态病理学改变及疏肝和胃汤的影响
光镜下，空白组大鼠盲肠黏膜形成的皱襞排列整齐均匀，无断裂，肠腺、血管分布于固有层和黏膜下层内。模型组黏膜上皮形成的皱襞杂乱无章，且有断裂；黏膜及黏膜下层可见炎症细胞浸润；肠隐窝截面积变小，有轻微的水肿现象；黏膜肌层不清晰，厚度不均一。和模型组相比，疏肝和胃汤低剂量组和疏肝和胃高剂量组盲肠黏膜断裂的皱襞不同程度恢复；盲肠细胞的水肿现象明显改善，肠隐窝截面积扩大；黏膜及黏膜下层可见少量炎症细胞浸润；黏膜肌层结构正常。四逆散组可见部分黏膜上皮断裂，局部盲肠细胞水肿，伴有黏膜及黏膜下层少量炎症细胞浸润，黏膜肌层厚度不均一。低聚果糖组盲肠黏膜皱襞连续，可见少量炎症细胞涌入腔内，未见明显盲肠细胞水肿，黏膜及黏膜下层可见少量炎症细胞浸润，黏膜肌层较清晰，厚度均一。
结论：
1.慢性应激属肝郁范畴，中医认为肝郁日久，影响及胃，与慢性应激引起的胃肠功能障碍在病因、症状及治疗方面具有相似性。肝郁失疏是慢性应激致胃肠功能紊乱的主要病因，肝郁犯胃是慢性应激致胃肠功能紊乱相关病证的主要证候之一，病位主要在肝，涉及脾、胃、肠等，疏肝和胃为治疗大法。
2.张仲景在《伤寒杂病论》中从六经辨证与脏腑辨证的角度，结合条文中的情志症状、胃肠症状，对应激导致的胃肠功能紊乱相关证候的辨治思路、理法方药提出了详细的论述，揭示了五行生克，脏腑相关的辨证规律，归纳了抑木扶土，疏肝和胃的辨治方法。
3.慢性应激引起的大鼠负性应激样行为，盲肠黏膜病理改变，肠道菌群紊乱（门水平Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria菌群丰度比例失衡，属水平Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group菌属丰度增加，Roseburia、Blautia菌属丰度降低，Prevotella_9、Prevotella_1菌属丰度降低）及其紊乱诱导的NLRP3炎症小体激活（血清中炎症小体NLRP3、Caspase-1与相关炎症分子IL-1β含量上升，IL-18含量下降，盲肠黏膜组织中NLRP3、ASC、Caspase-1及其mRNA表达增加，炎症因子IL-1β和IL-18及其mRNA表达增加），可能是慢性应激致胃肠功能紊乱的发病机制。
慢性应激指机体在长期缓慢的外界环境及精神压力刺激下产生的一种生理及心理障碍。当今社会生活节奏日益加快，人们往往因社会压力、不良情志刺激而长期处于慢性应激的状态之下，使精神和社会因素引发的疾病日益增多，严重危害公共健康。其中，慢性应激已成为影响胃肠功能的重要病因之一[1]。前期从慢性应激致胃肠功能紊乱的脑肠肽变化、PFC-NAc-VTA神经环路变化，深入研究了中医肝郁犯胃发生机制，最新研究指出，慢性应激可致肠道功能紊乱的同时，可出现肠道菌群变化，并诱导肠黏膜NLRP3炎症小体变化。因此，本研究拟进一步从“慢性应激-肠道菌群-炎症小体”的角度，研究中医肝郁犯胃证的发生机制，并通过观察疏肝和胃汤的影响，研究疏肝和胃汤调节胃肠功能的作用机制。本研究可为中医药防治此类疾病提供重要的理论和实验依据。
方法：
1.理论研究：采用文献分析方法，整理古代医家对慢性应激相关病证病因相同或相似的记载，归纳慢性应激致胃肠功能紊乱相关病证因机证候；并梳理分析《伤寒杂病论》中论及情志应激影响胃肠症状的条文，揭示慢性应激致胃肠功能紊乱相关证候的辨治规律；通过整理肠道菌群紊乱诱导的肠黏膜NLRP3炎症小体变化的文献，分析中医肝郁犯胃的胃肠症状与慢性应激致胃肠功能紊乱相关病证的相关性，提出从慢性应激致胃肠功能紊乱的肠道菌群、NLRP3炎症小体角度进行中医肝郁犯胃的研究思路。
2.实验研究：①模型制作及评价：采用慢性不可预知性应激结合孤养法造模3 w，造模完成后给予低、高两种不同浓度疏肝和胃汤（生药量分别为0.56 g/ml、1.12 g/ml），四逆散（生药量为0.28 g/ml）及低聚果糖灌胃干预7 d，观察大鼠一般情况及体质量增长；运用糖水偏好实验、旷场实验、强迫游泳实验，进行行为学评价；对粪便性状进行Bristol评分与含水率比较，评估模型大鼠肠功能。
②盲肠组织病理学观察：采用苏木精-伊红染色（HE染色）观察盲肠黏膜形态改变及其病理学变化；
③肠道菌群的检测：运用16S rRNA高通量测序技术观察慢性应激模型大鼠盲肠菌群组成、比例及丰度。
④炎症小体相关指标的检测：运用酶联免疫吸附测定（ELISA法）检测血清中NLRP3炎性小体及其相关炎症因子的含量；运用聚合酶链式反应（RT-PCR法）测定盲肠黏膜组织炎症小体NLRP3、Caspase-1、ASC及相关炎症因子IL-1β、IL-18 mRNA的相对表达量；运用免疫荧光（IF法）观察盲肠组织NLRP3、Caspase-1、ASC及相关炎症因子IL-1β、IL-18的阳性表达。
3.肠道菌群与炎症小体相关性分析：对慢性不可预知性应激大鼠盲肠菌群中差异菌种与血清及盲肠黏膜部分炎症小体及相关炎症因子进行Spearman相关分析，并使用PICRUSt针对16S rRNA扩增子测序结果进行功能预测，进行菌群COG功能分类分析及KEGG pathway丰度统计。
结果：
1.理论研究：古代文献分析发现，慢性应激类似于中医病因学说的情志致病，情志致病以影响脏腑气机为主，其病位主要在肝，反复长期的精神刺激归属中医肝郁证范畴。因情志失调，肝失疏泄，脾胃升降反常，肠腑传导失职，可见慢性应激致胃肠功能紊乱的相关情志及胃肠症状，肝郁犯胃证是慢性应激致胃肠功能紊乱相关病证的主要证候之一，以疏肝和胃，调畅气机为治疗大法。
现代医学发现慢性应激会导致肠道菌群紊乱，而肠道菌群紊乱可诱导肠黏膜NLRP3炎症小体激活，导致胃肠功能失调。因此可以从肠道菌群紊乱诱导的肠黏膜NLRP3炎症小体变化为切入点，研究肝郁犯胃的发生机制及疏肝和胃汤的作用机制。
2.实验研究：
实验一：慢性应激模型大鼠体质量、行为学、肠功能的变化及疏肝和胃汤的影响
①模型组大鼠体质量增长量显著下降，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；疏肝和胃汤低、高剂量组及低聚果糖组体质量增长量均不同程度上升，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；其中，疏肝和胃汤低、高剂量组体质量上升明显，与低聚果糖组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），四逆散组与低聚果糖组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
②模型组糖水偏好率明显下降，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；疏肝和胃汤低、高剂量组，四逆散组及低聚果糖组糖水偏好率升高，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；其中，疏肝和胃汤各剂量组及四逆散组与低聚果糖组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
③模型组旷场实验运动总距离明显缩短，静止时间明显延长，穿越中央区域次数减少，与空白组比较，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；疏肝和胃汤低、高剂量组，四逆散组及低聚果糖组运动总距离延长，疏肝和胃汤低、高剂量组静止时间明显缩短，疏肝和胃汤高剂量组穿越中央区域次数增多，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；其中，疏肝和胃汤低、高剂量组静止时间缩短，与低聚果糖组比较差异有统计学意义（P＜0.01），而运动总距离及穿越中央区域次数与低聚果糖组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
④模型组强迫游泳实验不动时间明显延长，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；疏肝和胃汤低、高剂量组强迫游泳实验不动时间明显缩短，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；其中，疏肝和胃汤低、高剂量组强迫游泳实验不动时间明显缩短，与低聚果糖组比较差异有统计学意义（P＜0.01），而四逆散组与低聚果糖组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
⑤模型组大鼠粪便Bristol评分明显提高，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；疏肝和胃汤低、高剂量组，四逆散组及低聚果糖组粪便Bristol评分明显下降，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；其中，疏肝和胃汤低、高剂量组Bristol评分明显缩短，与低聚果糖组比较差异有统计学意义（P＜0.01），而四逆散组与低聚果糖组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
⑥模型组大鼠粪便含水率下降，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；疏肝和胃汤低、高剂量组，四逆散组及低聚果糖组粪便含水率明显上升，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）；疏肝和胃汤低、高剂量组及四逆散组粪便含水率明显上升，与低聚果糖组比较差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。
实验二：慢性应激模型大鼠盲肠黏膜形态病理学改变及疏肝和胃汤的影响
光镜下，空白组大鼠盲肠黏膜形成的皱襞排列整齐均匀，无断裂，肠腺、血管分布于固有层和黏膜下层内。模型组黏膜上皮形成的皱襞杂乱无章，且有断裂；黏膜及黏膜下层可见炎症细胞浸润；肠隐窝截面积变小，有轻微的水肿现象；黏膜肌层不清晰，厚度不均一。和模型组相比，疏肝和胃汤低剂量组和疏肝和胃高剂量组盲肠黏膜断裂的皱襞不同程度恢复；盲肠细胞的水肿现象明显改善，肠隐窝截面积扩大；黏膜及黏膜下层可见少量炎症细胞浸润；黏膜肌层结构正常。四逆散组可见部分黏膜上皮断裂，局部盲肠细胞水肿，伴有黏膜及黏膜下层少量炎症细胞浸润，黏膜肌层厚度不均一。低聚果糖组盲肠黏膜皱襞连续，可见少量炎症细胞涌入腔内，未见明显盲肠细胞水肿，黏膜及黏膜下层可见少量炎症细胞浸润，黏膜肌层较清晰，厚度均一。
结论：
1.慢性应激属肝郁范畴，中医认为肝郁日久，影响及胃，与慢性应激引起的胃肠功能障碍在病因、症状及治疗方面具有相似性。肝郁失疏是慢性应激致胃肠功能紊乱的主要病因，肝郁犯胃是慢性应激致胃肠功能紊乱相关病证的主要证候之一，病位主要在肝，涉及脾、胃、肠等，疏肝和胃为治疗大法。
2.张仲景在《伤寒杂病论》中从六经辨证与脏腑辨证的角度，结合条文中的情志症状、胃肠症状，对应激导致的胃肠功能紊乱相关证候的辨治思路、理法方药提出了详细的论述，揭示了五行生克，脏腑相关的辨证规律，归纳了抑木扶土，疏肝和胃的辨治方法。
3.慢性应激引起的大鼠负性应激样行为，盲肠黏膜病理改变，肠道菌群紊乱（门水平Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria菌群丰度比例失衡，属水平Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_group菌属丰度增加，Roseburia、Blautia菌属丰度降低，Prevotella_9、Prevotella_1菌属丰度降低）及其紊乱诱导的NLRP3炎症小体激活（血清中炎症小体NLRP3、Caspase-1与相关炎症分子IL-1β含量上升，IL-18含量下降，盲肠黏膜组织中NLRP3、ASC、Caspase-1及其mRNA表达增加，炎症因子IL-1β和IL-18及其mRNA表达增加），可能是慢性应激致胃肠功能紊乱的发病机制。