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葡萄遗传背景复杂,育种周期长,常规育种方法较难实现品种改良,随着转基因技术的出现和发展,把目的基因转入植物体内,可在不改变多种优良性状的前提下定向改良某些性状,提高育种效率,为葡萄的育种改良提供了一条新途径。
葡萄再生频率低是造成葡萄遗传转化困难的关键因素之一。本研究以优良酿酒葡萄品种歌海娜(Grenache)、霞多丽(Chardonnay)、西腊(Syrah)及砧木3309试管苗为试材,对影响离体茎段不定芽诱导的因素,如基因型、接种外植体类型、基本培养基类型、生长调节剂种类及浓度配比、接种方式以及培养条件等进行了较系统的研究,建立了歌海娜、西腊及霞多丽离体茎段再生体系;以酿酒葡萄品种霞多丽胚性细胞系为试验材料,采用GUS检测法,对影响农杆菌介导的遗传转化的因素如超声波处理时间、AS浓度、DTT浓度进行了研究,优化了遗传转化的条件;并以歌海娜、西腊离体茎段为试验材料,进行了抗寒目的基因CBF1转化葡萄的研究。
主要研究结果如下:
1.基因型是影响葡萄离体茎段再生的重要因素,研究结果表明:歌海娜品种的不定芽诱导效率显著高于西腊和霞多丽品种。
2.通过对不同培养基的筛选,确定了MS培养基为霞多丽离体茎段诱导不定芽的最适基本培养基。
3.歌海娜、霞多丽和西腊三种基因型中,仅从茎段外植体诱导出不定芽,而叶片和叶柄外植体均未能诱导出不定芽。茎段不同接种方式对不定芽的诱导效果有显著影响。
4.植物生长调节剂对离体茎段不定芽的诱导有较大影响。细胞分裂素BA能使歌海娜、霞多丽、西腊及砧木3309等四种基因型的离体茎段诱导产生不定芽,而TDZ只能诱导西腊及砧木3309的茎段产生不定芽,而且BA对不定芽的诱导效率要高于TDZ,由TDZ诱导的不定芽畸形较多,不易成苗。歌海娜离体茎段最适再生培养基为:MS+BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L,不定芽诱导率为25%;西腊离体茎段再生培养基为:MS+BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L,不定芽诱导率为5.9%;砧木3309离体茎段再生培养基为:MS+BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L,不定芽诱导率为9.5%;不定根诱导培养基为:1/2MS+IAA0.05mg/L。霞多丽茎段诱导丛生不定芽的最适培养基为:MS+BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L。
5.暗培养处理可显著提高茎段的不定芽诱导率,适宜暗培养时间为14d左右。
6.通过对影响农杆菌介导葡萄胚性细胞系遗传转化效率因素的研究表明,AS浓度、DTT浓度及超声波处理时间对胚性细胞系转化效率有明显影响,以AS浓度100μmol/L、DTT浓度3mg/L、超声波处理时间5min为葡萄胚性细胞系的较适合转化条件。
7.酿酒葡萄离体茎段诱导的不定芽对潮霉素较敏感,潮霉素1.0mg/L即达到歌海娜、西腊诱导不定芽的致死浓度,可作为转化后抗性不定芽的筛选浓度。