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随着蛋白质化学技术的突破性进展,双/多特异性抗体的构建方法和表达技术不断创新。目前绝大多数双/多特异性抗体是靶向T细胞并强化T细胞功能为原理设计的,已经进入临床试验和临床实用的产品展示出诱人前景。NK细胞是机体T细胞之外抗肿瘤的二大利器之一,本身具有广谱的肿瘤杀伤能力,尤其在对抗冷肿瘤时展现出独到的优势,近期被广泛关注。同时,NK细胞具有强大的增强T细胞抗肿瘤免疫应答的能力,是T细胞发挥抗肿瘤的功能基础。由于NK细胞在体内存活时间较短,极大地限制了它在免疫治疗中的作用。我们构建了三特异性抗体用于再导向NK细胞,以此来研究它对NK细胞抗肿瘤作用的增强效应。1、双/三特异性抗体构建、表达与鉴定我们设计并构建了三特异性抗体161519,它是由一段抗人CD16单链抗体、修饰人IL-15细胞因子和抗人CD19单链抗体组成。通过原核表达载体进行诱导表达,之后通过包涵体变、复性获得了可溶形式的蛋白,利用SDS-PAGE和质谱鉴定了纯度和精确分子量。我们也将161519分子构建到真核表达载体,通过CHO细胞表达并利用亲和层析纯化获得了纯度较高的蛋白。作为对照,我们也设计了双特异性抗体1619(在161519分子基础上去掉了 IL-15片段),利用原核表达系统和真核表达系统来表达并纯化获得了纯度较高的可溶蛋白。2、三特异性抗体促进NK细胞与CD19+肿瘤细胞交联为了研究161519抗体与对应靶细胞的特异结合活性,我们通过流式细胞术观察到它可以分别与NK细胞或CD19+肿瘤细胞特异结合。进一步利用细胞交联实验(conjugation),我们采用流式细胞术和免疫荧光成像技术,发现161519抗体可以促进NK细胞与CD19+肿瘤细胞的特异交联。3、三特异性抗体促进NK细胞活化和增殖通过NK细胞与CD19+肿瘤细胞共孵育,我们发现161519抗体可以促进NK细胞表达活化相关的分子CD69和与杀伤相关的功能分子TRAIL和granzyme B,同时NK细胞分泌IFN-γ的水平也显著提高,而这一过程并不会激活T细胞应答。更重要的是,相比双特异性抗体1619,三特异性抗体161519促进NK细胞增殖的能力显著更高。4、三特异性抗体提高NK细胞杀伤活性NK细胞对靶细胞的直接杀伤活性是检验NK细胞功能的一个重要指标。结果显示,161519抗体可以显著提高NK细胞对CD19+肿瘤细胞的杀伤能力,而对CD19-肿瘤细胞则无明显影响。我们进一步将161519抗体与NK细胞预孵育(Arming),发现这种负载161519抗体的NK细胞具备更强的针对CD19+肿瘤细胞的杀伤能力,证实其可以特异提高NK细胞杀伤活性。5、真核细胞表达的三特异性抗体具有更强的生物学功能我们对比了真核细胞表达系统或原核细胞表达系统生产的三特异性抗体的差异。我们观察到真核细胞表达系统生产的161519抗体比原核细胞系统表达的抗体具有显著的高杀伤活性,展现出远低于原核161519抗体的响应剂量。同时,真核161519具有更强的促进NK细胞活化和增殖的能力。6、三特异性抗体在体内可以减缓肿瘤生长并延长生存期为了评估161519抗体的体内抗肿瘤效应,我们构建了人源化小鼠模型。结果发现161519抗体可以显著减缓人CD19+肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠体内的生长,并显著延长小鼠生存期。我们观察到,1619抗体单用没有明显治疗作用,与IL-2联合治疗后可取得疗效,可以延长小鼠生存期。而161519抗体单用则可以显著抑制小鼠体内肿瘤生长,不需要联合使用IL-2。以上结果提示IL-2在161519抗体治疗中并非必需,而1619抗体的体内疗效则依赖IL-2存在。