论文部分内容阅读
传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)是鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)的病原体，持续不断地威胁着世界养禽业的发展。本研究的目的是以Bac-To-Bac杆状病毒表达系统表达的IBDV VP4蛋白为检测抗原，建立VP4蛋白抗体间接酶联免疫吸附检测(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)方法。
将传染性法氏囊病病毒VP4基因、EGFP-VP4、EGFP基因分别插入到pFastBac HTA转移载体中，在细菌Tn7转座子的作用下使转移载体与存在于Escherichia coli DH10Bac感受态细胞中的杆状病毒基因组发生转座反应，形成重组杆状病毒载体Bacmid aVP4、Bacmid pVP4、Bacmid EGFP-VP4和BacmidEGFP。Bacmid EGFP-VP4和Bacmid EGFP质粒转染Sf9细胞可观察到绿色荧光蛋白的表达，间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay，IFA)和Western blot证实，表达的蛋白能与抗VP4蛋白抗体发生特异性反应。将重组病毒Bacmid aVP4和Bacmid pVP4感染High5细胞，应用IFA和Western blot证实，表达的蛋白能与抗VP4蛋白的单克隆抗体发生特异性反应，分子量集中在26-32kDa。磷酸化质谱鉴定，结果显示，表达的VP4蛋白的26S被磷酸化。杆状病毒表达的aVP4和pVP4蛋白等量免疫SPF鸡后，方差齐性检验(F检验)结果显示，aVP4和pVP4的抗体效价没有显著性差异，说明IBDV强毒和弱毒的VP4蛋白免疫原性相似。
以杆状病毒表达系统表达的VP4蛋白为抗原，建立了检测IBDV VP4抗体的间接ELISA方法VP4-ELISA。试验的最佳反应体系为：包被抗原浓度为4μg/mL，包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，封闭液为5％脱脂奶，样品稀释液为含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液；待检血清稀释倍数为1:800，酶标二抗稀释倍数为1:8000；待检血清反应时间为60 min，酶标二抗反应时间为45 min，底物反应时间为10 min。以S/P值等于0.0995作为VP4抗体阳性血清判定的临界值。特异性检测表明，建立的方法不与禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒阳性血清发生交叉反应。稳定性检测表明，批内抗原检测板的变异系数(CV)值在0.8-6.6％之间，批间抗原检测板的CV值在6.31-14.99％之间。与IFA结果相比，阳性符合率为85.19％，阴性符合率为82.93％，总符合率为84.96％。