犬新孢子虫（Neospora caninum）简称新孢子虫,是一种寄生在细胞内的原虫,宿主范围非常广泛。新孢子虫表面蛋白SRS家族（SRSs）基因编码新孢子虫表面蛋白在介导虫体对宿主细胞的粘附和入侵中发挥重要作用。细胞因子IL-18由多种组织的细胞产生,可以与IL-12产生协同作用,能诱导Th1细胞产生各种细胞因子,诱导NK细胞产生细胞毒活性,促进T细胞增殖。本实验室前期研究发现在新孢子虫感染中宿主可通过介导IL-18的分泌使其促进新孢子虫清除,诱导分泌血清中的IFN-γ,促进宿主对抗新孢子虫感染免疫应答过程中的Th1型。本研究拟在SRS家族中找出对抗新孢子虫感染保护效果较好的蛋白,并验证IL-18作为佐剂是否可以增强重组蛋白的保护效果。为新孢子虫疫苗进一步的研制奠定基础。新孢子虫SRSs与小鼠IL-18及NcSRS2-mIL-18重组质粒的构建及蛋白表达表达通过生物信息学分析选取SRS2、SRS17以及SRS52共三个基因。扩增得到新孢子虫表面蛋白基因SRS2、SRS17、SRS52,大小分别为1041bp、1095bp、921bp,将结果进行BLAST比对,发现新孢子虫SRS2、SRS17、SRS52基因核苷酸序列与GenBank收录的新孢子虫NCLIV₀33250（SRS2）、NCLIV₀68920（SRS17）、NCLIV₀69780（SRS52）同源性100%。以小鼠巨噬细胞cDNA（经LPS处理）为模板扩增得到成熟片段区域的小鼠白介素18基因（mIL-18）,大小为471bp。以SRS2以及mIL-18为模板成功构建串联重组载体pET-32a-NcSRS2-mIL-18。将重组质粒pET-32a-NcSRS2、pET-32a-NcSRS17、pET-32a-NcSRS52、pET-32a-mIL-18、pET-32a-NcSRS2-mIL-18通过转化进入大肠杆菌感受态BL21（DE3）后,经SDS-PAGE分析蛋白的表达及其分子量,分别获得大小约为58kDa（SRS2）、60kDa（SRS17）、54kDa（SRS52）、37kDa（mIL-18）、77kDa（SRS2-mIL-18）5个蛋白。重组蛋白均可在上清中表达,经Western Blot验证5个蛋白均具有反应原性。抗新孢子虫重组蛋白SRS2、SRS17、SRS52多克隆抗体的体外阻断实验将SRS2、SRS17、SRS52三个重组蛋白分别免疫小鼠,取三免后血清,对血清抗体进行稀释后与新孢子虫速殖子进行孵育,将孵育后的速殖子加入MDBK细胞培养瓶中,观察抗血清对新孢子虫入侵和增殖的影响。试验结果表明抗SRS2、SRS17和SRS52重组蛋白多克隆抗体在新孢子虫对宿主细胞的粘附入侵方面均起到一定程度的抑制作用,且SRS17效果优于SRS2和SRS52。SRSs,鼠IL-18,SRS2-mIL-18重组蛋白对小鼠新孢子虫感染的免疫保护作用将70只BALB/c小鼠随机分为7组,小鼠包括5个试验组（SRS2,SRS17,SRS52,mIL-18和SRS2-mIL-18）、阴性和阳性2个对照组,试验组分别对小鼠进行三次皮下免疫,三免后10天采集小鼠血清,利用ELISA测定抗体和细胞因子产生的水平。三免结束后第14天用3×10⁷新孢子虫速殖子对小鼠进行腹腔接种,每天观察并记录小鼠的存活情况和体重变化。20天后收集心、肝、脾、肺、肾和脑各组织,制作病理切片并观察病理变化;同时提取基因组,经荧光定量PCR检测小鼠脑组织荷虫量。结果发现免疫后SRS重组蛋白可提高小鼠的IFN-γ分泌水平,其中SRS2-mIL-18组小鼠的IFN-γ明显高于SRS2组（P<0.05）。此外,SRS17组的IFN-γ高于SRS2和SRS52组。感染后与阳性对照组相比,各实验组均可显著降低小鼠的死亡率,各组小鼠存活率分别如下:阳性对照组为16%,SRS52组为67%,SRS2和mIL-18组均为83%,SRS17组和SRS2-mIL-18组及阴性对照组为100%。SRS2-mIL-18组小鼠组织的无明显病变,而且脑组织中的荷虫量比其他组都低。实验结果表明与NcSRS2相比,NcSRS17、NcSRS52蛋白均可以诱导体液和细胞免疫反应,具有一定的保护性,SRS17蛋白的保护效果更好。此外,IL-18可以提高NcSRS2的保护效果。山羊IL-18及NcSRS17-gIL-18的重组质粒的构建及表达成功扩增了成熟片段区域的山羊白介素18基因（gIL-18）,大小为471bp,将结果进行BLAST比对,发现与GenBank收录的山羊NM₀08360.2同源性100%。选取对小鼠保护效果较好的SRS17,将其和gIL-18串联,成功构建重组载体pET-32a-NcSRS17-gIL-18。将pET-32a-gIL-18和pET-32a-NcSRS17-gIL-18两个重组质粒分别转化BL21（DE3）后,经SDS-PAGE分析表达蛋白,分别获得分子量大小约为37kDa、73kDa的重组蛋白。这2种重组蛋白均可在上清中表达,经Western Blot验证它们均具有反应原性。山羊IL-18及NcSRS17-gIL-18重组蛋白对山羊新孢子虫感染的免疫保护作用将8只山羊随机分为4组,每组2只,包括两个实验组（SRS17,SRS17-gIL-18）和阴性阳性两个对照组。用重组蛋白SRS17和SRS17-gIL-18对山羊进行免疫,免疫结束后对山羊血清抗体效价、细胞因子水平进行检测。免疫结束15天,实验组和阳性对照组每只羊血液接种10⁹新孢子虫。攻虫40天后处死山羊,取心、肝、脾、肺、肾、脑各组织做切片,HE染色观察病变情况。提取各组山羊脑基因组做荧光定量PCR检测荷虫量。结果显示,SRS17组山羊血清效价约为1×10⁵,SRS17-gIL-18组山羊血清效价约为2×10⁵,各实验组IL-4、IL-12和IFN-γ细胞因子分泌水平均有升高,和阴性组相比差异显著,表明gIL-18和SRS17-gIL-18重组蛋白均可以刺激山羊机体产生Th1/Th2免疫应答。且SRS17-gIL-18组各细胞因子分泌水平均高于SRS17组,表明IL-18提高了SRS17的保护作用。切片HE染色结果显示与阳性对照组相比两个实验组各组织无明显病变。荧光定量PCR结果显示SRS17和SRS17-gIL-18与阳性对照组相比均可显著降低山羊脑组织荷虫量。