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研究背景上世纪九十年代以来,诸多研究者在多种心血管疾病患者的血清中检测到针对M2胆碱能受体细胞外第二环的自身抗体(Autoantibodies Against M2-muscarinic acetylcholine receptor, M2-AA)。进一步的功能学研究发现,该自身抗体具有类似M2受体激动剂卡巴胆碱的作用,对离体培养的心肌细胞产生负性变时效应,且对受体的刺激作用不易脱敏。因此推测,M2-AA长期存在下,可能通过激活M2受体干扰心脏的正常功能,进而导致心脏的病理损害。本研究室1998年用合成的M2受体细胞外第二环肽段作为抗原长期免疫大鼠,结果观察到在免疫的过程中,伴随着M2-AA滴度的升高和作用时间的延长,心肌组织出现类似扩心病的病理和功能改变;在免疫过程中,心肌细胞线粒体呈现空泡样变性和心肌细胞灶状丢失,并有淋巴细胞浸润。这一结果高度提示循环血液中的M2-AA可能参与了自身免疫介导的心脏疾患的发生。但是,上述研究采用的动物模型为主动免疫模型,主动免疫时注入动物体内的抗原本身也可能导致心肌损伤的发生,因此该研究尚不足以得出M2-AA可以直接导致心肌损伤的结论;另一方面,主动免疫模型所产生的M2-AA远远高于临床患者血清中该抗体的滴度,因而难以用主动免疫模型研究的结果来解释临床病例。因此,建立血清M2-AA浓度类似临床实际情况的被动免疫动物模型,是进一步研究M2-AA病理生理学意义所必需的基本实验手段。在前述的主动免疫模型中,受损心肌组织有淋巴细胞浸润也是一个不容忽视的病理现象,提示我们可能有某些因素激活了机体的免疫系统。而免疫系统的激活等导致的免疫系统紊乱是高血压、冠心病、扩心病、肥厚性心肌病及风心病等多种疾病恶化的重要原因,已得到国内外专家的公认。已知T淋巴细胞是执行机体免疫应答的主力军,具有直接杀伤靶细胞、辅助或抑制B细胞产生抗体、对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等多种生物学功能。根据文献报道,在人类和鼠类的T淋巴细胞上都存在M2受体,副交感神经递质ACh可以通过该受体参与免疫调节作用。鉴于M2-AA具有类似M2受体激动剂的作用,因此推测,循环血液中的M2-AA可能会与T淋巴细胞表面的M2受体结合,进而影响T淋巴细胞的活性。但是,M2-AA是否直接参与T淋巴细胞的激活有待进一步确定。如果参与,其参与的方式有必要进行深入研究。在机体的特异性免疫应答中,CD4+T细胞是主要的效应T细胞,参与免疫应答的各个阶段,并在免疫调节中发挥关键作用。传统观点将CD4+T细胞分为辅助性T细胞1型(Thelper cell 1, Th1)、辅助性T细胞2型(T helper cell 2, Th2)和调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)。近年来的研究发现,机体存在一种参与自身免疫和炎症反应的新型CD4+T细胞-辅助性T细胞17型(T helper cell 17, Th17),该细胞通过分泌产生白细胞介素17(Interleukin 17, IL-17,即IL-17A)、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-6和肿瘤坏死因子a (Tumor Necrosis Factor a, TNF-a)等,进而发挥其集体动员、募集及活化中性粒细胞的作用。有研究报道,Th17细胞及其特征性细胞因子IL-17可能是自身免疫性心肌损伤的重要因素。如果能特异性观察M2-AA是否直接影响Thl7细胞的功能活动,则有可能进一步提供M2-AA具有调节免疫细胞功能活性的直接证据,为研究M2-AA的病理生理学意义提供新的切入点。研究目的(1)建立与临床患者血清中M2-AA滴度相匹配的M2-AA被动免疫大鼠模型,观察该抗体长期存在是否能够影响心脏的结构和功能,以及机体的免疫功能,以探讨M2-AA是否具有直接导致心肌损伤和调控机体免疫功能的作用。(2)分离培养大鼠T淋巴细胞,观察M2-AA是否直接影响T淋巴细胞的功能活动,以探讨M2-AA是否可激活T淋巴细胞介导的免疫反应,并探讨M2-AA是否具有除心脏以外的作用位点。(3)分离培养人外周血单个核细胞,刺激诱导其中初始CD4+T细胞发育分化为Th17淋巴细胞,观察M2-AA是否影响Th17淋巴细胞的功能活动。研究方法(1)根据大鼠M2受体细胞外第二环163-184位的氨基酸序列合成抗原肽段,建立主动免疫大鼠模型,采用SA-ELISA法监测M2-AA的产生情况。(2)利用亲和层析法提纯免疫鼠血清中的M2-AA IgGs, SDS-PAGE凝胶电泳鉴定IgGs的纯度,采用BCA法测定蛋白含量,ELISA法鉴定所提纯的M2-AA IgGs亚类。(3)选择血清M2-AA阴性大鼠建立M2-AA被动免疫模型,利用MS2000生物信号记录分析系统定期监测大鼠心功能的变化情况,并采集心肌组织标本,经相应处理后进行光镜和电镜观察。(4)分离M2-AA被动免疫大鼠脾脏T淋巴细胞,进行细胞免疫荧光染色,采用流式细胞术测定CD4+/CD8+T淋巴细胞比值。(5)急性分离培养正常大鼠脾脏T淋巴细胞,进行细胞免疫荧光染色,采用激光扫描共聚焦显微镜观察鉴定。(6)采用CCK-8法,检测经M2-AA干预后T淋巴细胞的增殖状况,以观察M2-AA对T淋巴细胞增殖功能的影响;利用ELISA检测试剂盒,测定经M2-AA干预后的T淋巴细胞培养上清中IL-4、IL-10、IL-17、IL-21及IL-22含量。(7)采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞并培养,加入诱导剂与刺激剂促进初始CD4+T淋巴细胞诱导分化为Th17淋巴细胞,进行细胞免疫荧光染色(包括细胞内因子染色),采用激光扫描共聚焦显微镜观察鉴定。(8)采用CCK-8法,检测经M2-AA干预后Th17淋巴细胞的增殖水平,以观察M2-AA对Th17细胞增殖功能的影响;利用ELISA检测试剂盒,测定经M2-AA干预后的Th17细胞培养上清中IL-17、IL-21及IL-22含量。研究结果1.M2-AA的制备、提纯、定性及定量检测结果1.1 M2抗原肽段主动免疫大鼠模型建立成功SA-ELISA法测定结果显示:免疫后2周,与对照组相比,M2免疫组血清M2-AA的水平已明显升高,到8周时达峰值(血清M2-AA的OD值:2.93±0.11νs,s.0.21±0.02,P<0.01),之后到10周,M2-AA水平虽有下降趋势,但仍高于同期对照组(2.82±0.33νs.0.20±0.02,P<0.01)(图1-1)。本结果提示主动免疫模型建立成功。1.2 M2-AA IgGs的提纯、定性、定量及亚类检测结果采用亲和层析法提纯免疫鼠血清中的IgGs,得到含M2-AA的总IgGs。经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度,结果显示在55KDa和25KDa附近可见清晰的两条带,分别代表IgGs的重链和轻链(图1-2A)。经BCA法测定纯化的IgGs蛋白浓度为2.39mg/mL。IgGs亚类测定结果显示,所提纯的M2-AA主要为IgG2a亚类(图1-2B)。2 M2-AA被动免疫大鼠发生心脏损伤2.1 M2-AA被动免疫大鼠模型建立成功M2-AA被动免疫后4周,大鼠血清M2-AA含量已明显高于对照组(OD值:0.355±0.03νs.0.103±0.04,P<0.05),之后M2-AA持续保持在一定水平,到24周时仍高于对照组(OD值:0.388±0.04νs.0.098±0.08,P<0.05)(图1-3)。结果表明M2-AA被动免疫大鼠模型建立成功。2.2 M2-AA被动免疫大鼠的心功能下降心功能监测中,LVSP与+dp/dtmax是反映心脏收缩功能的参数,LVEDP与-dp/dtmax反映心脏舒张功能。结果显示:被动免疫16周时,M2-AA免疫组LVEDP (KPa)明显升高(1.53±0.91νs.同期对照组1.38±0.61,P<0.05)(图1-4B),而+dp/dtmax (KPa/sec)则出现降低(302.43±39.1νs.369.18±30.6,P<0.05)(图1-4C)。到24周时,M2-AA组LVSP (KPa)出现降低(9.06±2.20νs.13.92±2.81,P<0.05)(图1-4A),LVEDP增高(2.96±0.52νs.1.29±0.61,P<0.01),+dp/dtmax降低(213.06±40.32νs.360.32±26.81KPa/s,P<0.01),-dp/dtmax(KPa/sec)出现增加(-163.96±28.52 vs.-225.29±12.71 KPa/s, P<0.01)(图1-4D)。综上所述,M2-AA长期存在可导致心功能下降。2.3 M2-AA被动免疫大鼠心重/体重比值下降心重与体重比值(HW/BW, mg/g)测定结果显示:在免疫第16周时,M2-AA免疫组的HW/BW值明显降低(2.23±0.10νs.对照组2.48±0.11,P<0.05),到24周时降低更为明显(2.15±0.09νs.对照组2.51±0.07,P<0.01)(图1-5C)。这一结果提示,M2-AA在体内长期作用的情况下,可能发生了心肌细胞丢失现象。2.4 M2-AA被动免疫大鼠导致心肌损伤心脏体视学检查发现:在免疫24周时,M2-AA免疫组的心脏体积明显变大,心腔扩张(图1-5 A,B)。光镜观察结合图像分析发现:免疫24周时,M2-AA免疫组心肌细胞形态发生明显改变,间质有淋巴细胞浸润;而对照组心肌组织形态与间质均正常(图1-6)。观察心肌组织电镜标本发现:免疫24周时,M2-AA免疫组的心肌出现明显的线粒体肿胀、广泛空泡样变性、基质变清、线粒体嵴结构不清;心肌肌原纤维排列紊乱、明暗带缺损、部分断裂。对照组心肌超微结构显示线粒体大小、形态及分布正常;心肌肌原纤维排列整齐,肌小节结构清晰(图1-7)。以上这些结果说明,M2-AA在体内长期存在的情况下,可导致心肌损伤。2.5 M2-AA被动免疫后大鼠脾脏CD4+/CD8+T淋巴细胞比值增加实验结果显示:免疫12周时,M2-AA免疫组的CD4+/CD8+比值明显增高(3.06±0.28νs.对照组1.92±0.38,P<0.05),之后呈持续增高趋势,到24周时仍明显高于对照组(3.47±0.31νs.1.82±0.33,P<0.01)(图1-8)。这一结果提示,M2-AA在体内长期存在的情况下,可导致机体的细胞免疫功能发生紊乱。3 M2-AA促进大鼠T淋巴细胞的增殖与分泌作用3.1成熟T淋巴细胞的激活及鉴定于倒置显微镜下观察可见:在分离的大鼠脾淋巴细胞中未加入ConA时,淋巴细胞呈圆形;加入ConA后刺激培养72h,细胞的体积增大,数量明显增多,形态有不规则形、长梭形、三角形等(图2-1)。根据T淋巴细胞特征性的表面标志,采用荧光标记抗体CD3-FITC与CD4-PE进行鉴定。结果可见大部分细胞膜表面呈现绿色荧光阳性,表明是T淋巴细胞;少数细胞膜表面呈绿色与红色荧光双阳性,为辅助性T细胞(Th细胞)(图2-2)。3.2 Con A可激活大鼠脾脏T淋巴细胞采用CCK-8试剂盒检测淋巴细胞活性结果显示:体外培养的大鼠脾淋巴细胞中加入ConA后,细胞活性明显高于未加ConA的对照组(0.442±0.05νs.0.126±0.03,P<0.01)(图2-3)。表明Con A能够成功激活T淋巴细胞。3.3 M2-AA浓度依赖性促进大鼠T淋巴细胞增殖实验结果显示:0.1μmol/L的M2-AA使细胞的活性水平明显升高(OD值:0.561±0.08νs.空白对照组0.439±0.05,P<0.05)(图2-4),同一浓度的氧化震颤素(选择性M2受体激动剂)也具有促T淋巴细胞增殖作用(P<0.05)。三个浓度的M2-AA(0.01,0.1,1μmol/L)可浓度依赖性促进T淋巴细胞增殖(OD值:0.01:0.496±0.06νs.0.311±0.05,P<0.05;0.1:0.687±0.08νs.0.420±0.06,P<0.01;1:0.783±0.11νs.0.461±0.08,P<0.01)(图2-5)。同样浓度的氧化震颤素也能够浓度依赖性促进T淋巴细胞增殖。3.4 M2-AA通过M2受体介导促T淋巴细胞增殖作用实验结果显示:T淋巴细胞悬液中同时加入M2-AA与M2受体拮抗剂Methoctraine(美索曲明)的混合液,M2-AA对T淋巴细胞的促增殖作用被抑制(图2-6)。此外,T淋巴细胞悬液中同时加入M2-AA与M2R peptide(M2受体肽段)的混合液,M2-AA对T淋巴细胞的促增殖作用也被抑制(图2-7)。这一结果表明:M2-AA是通过特异性与T淋巴细胞M2受体的细胞外第二环结合,进而实现其促T淋巴细胞增殖作用。3.5 M2-AA能够促进T淋巴细胞分泌IL-4与IL-10实验结果显示:0.1μmol/L与1μmol/L的M2-AA可明显增加T淋巴细胞IL-4的分泌量(图2-8)与IL-10的分泌量(图2-9),而对IL-17、IL-21、IL-22的分泌量无明显影响(表1)。4 M2-AA促进人Th17淋巴细胞的增殖与分泌作用4.1 Thl7淋巴细胞的形态学观察与鉴定于倒置显微镜下观察可见:细胞液中未加任何刺激剂时,淋巴细胞呈正常的圆形;而加入一系列的刺激剂培养7天后,细胞形态发生明显改变,有不规则形、长梭形、三角形等,表明细胞已发生明显的分化(图3-1)。由于目前尚未发现Th17淋巴细胞特征性的表面标志,故采用胞膜CD3-FITC与CD4-APC荧光抗体双染,结合胞内细胞因子IL-17-PE染色的方法进行鉴定。结果细胞膜表面呈绿色与蓝色荧光双阳性,且胞内发红色荧光者即为Thl7淋巴细胞(图3-2)。4.2 M2-AA浓度依赖性促进Th17淋巴细胞增殖加入诱导剂与激活剂后,Th17淋巴细胞的活性明显升高(0.398±0.12νs.对照组0.051±0.03,P<0.01)(图3-3)。表明加入诱导剂与激活剂,可使Thl7淋巴细胞活化成熟。0.1μmol/L的M2-AA使Th17细胞活性水平明显升高(0.554±0.09νs.对照组0.419±0.05,P<0.05)(图3-4)。同一浓度的氧化震颤素也表现出相同的效应(P<0.05)。三个浓度的M2-AA(0.01,0.1,1μmol/L)可浓度依赖性促进Th17淋巴细胞增殖(0.01:0.443±0.03νs.0.404±0.03,P<0.05;0.1:0.554±0.09νs.0.424±0.06,P<0.01;1:0.569±0.07νs.0.449±0.06,P<0.01)。同样浓度的氧化震颤素也能够浓度依赖性促进Th17淋巴细胞增殖(图3-5)。4.3 M2-AA通过M2受体介导促Th17淋巴细胞增殖作用Thl7淋巴细胞悬液中同时加入M2-AA与M2受体拮抗剂Methoctraine(美索曲明)的混合液,M2-AA对Th17淋巴细胞的促增殖作用被抑制(图3-6)。此外,Th17淋巴细胞悬液中同时加入M2-AA与M2R peptide(M2受体肽段)的混合液,M2-AA对Th17淋巴细胞的促增殖作用也被抑制(图3-7)。这一结果表明:M2-AA是通过特异性与Th17淋巴细胞M2受体的细胞外第二环结合,进而实现其促Th17淋巴细胞增殖作用。4.4 M2-AA能够促进Th17细胞分泌IL-17、IL-21与IL-220.1μmol/L的M2-AA可明显增加Thl7细胞IL-17的分泌量(0.049±0.01νs.0.043±0.01,P<0.05)(图3-8),及IL-21的分泌量(0.048±0.01 vs.0.042±0.01,P<0.05)(图3-9),并且1μmol/L的M2-AA这些作用更为明显(P<0.01)。此外,1μmol/L的M2-AA可明显增加Th17细胞IL-22的分泌量(0.053±0.01νs.0.044±0.01,P<0.05)(图3-10)。同样,0.1μmol/L与1μmol/L的氧化震颤素也可增加Th17细胞对这三种细胞因子的分泌量。结论(1)M2-AA以和临床患者血清滴度相匹配的浓度在体内长期存在的情况下,可引发心肌损伤和机体细胞免疫功能紊乱。(2)在一定范围内,M2-AA可浓度依赖性促进体外培养的T淋巴细胞增殖,并且增殖的T淋巴细胞分泌功能增强。表明除心肌细胞以外,T淋巴细胞的M2受体也是M2-AA的作用靶点。(3)在一定范围内,M2-AA可剂量依赖性促进体外培养的Th17淋巴细胞增殖,并且增殖的Th17淋巴细胞分泌功能增强。