论文部分内容阅读
养猪生产中，仔猪免疫应激引发的氧化应激和炎症对养猪业造成了极大的危害。研究表明，MAPK信号通路在应激反应、细胞凋亡中起着至关重要的作用，同时TLR4-NF-κB信号通路也能诱导细胞因子的表达，引起免疫应激性炎症。本项目组在前期实验中已证实了对乙酰氨基酚（AAP）联合乙酰半胱氨酸（NAC）能有效缓解仔猪免疫应激性炎症。本论文采用体外和体内模型，进一步研究两种药物缓解仔猪免疫应激相关的MAPK和TLR4-NF-κB信号通路的影响。1.对乙酰氨基酚与乙酰半胱氨酸单用和联用对脂多糖诱导后仔猪MAPK信号通路的影响体外试验：方法：将分离后培养的仔猪外周血单核细胞分别设空白对照组、脂多糖(LPS)造模组、AAP组（浓度为0.5和1mM）、NAC组（浓度为0.5和1mM）和联合用药组（两药浓度均为0.5和1mM组合），药物预处理1h后加入终浓度为1μg/mL的LPS，继续培养0.5和3h后，采用Western blot方法测定LPS刺激0.5h后的单核细胞中JNK、p-JNK、p-ERK和p-p38的含量；采用RT-PCR方法测定LPS刺激3h后的单核细胞中Bax、Bcl-xL、Fasl的mRNA表达量；采用Western blot方法测定LPS刺激3h后的单核细胞中Caspase-3的含量。结果：①脂多糖诱导0.5h后，细胞中JNK上升不显著，p-JNK、p-ERK和p-p38极显著上升（P<0.01）。乙酰半胱氨酸在0.5-1.0mM范围内增强对乙酰氨基酚抑制脂多糖诱导的JNK蛋白表达变化不显著，乙酰半胱氨酸浓度在浓度0.5mM和1mM时，能极显著地（P<0.01）增强对乙酰氨基酚（0.5、1mM）对p-ERK和p-p38活化的抑制效果；乙酰半胱氨酸浓度在0.5mM时，能极显著地（P<0.01）增强对乙酰氨基酚（0.5mM）对p-JNK的抑制效果，乙酰半胱氨酸浓度在1mM时不影响（P>0.05）对乙酰氨基酚（1mM）对p-JNK的抑制效果；②脂多糖诱导3h后，单核细胞Bax、Bcl-xL、Fasl mRNA表达均极显著上调（P<0.01）。乙酰半胱氨酸浓度在0.5mM时，能显著地（P<0.05）增强对乙酰氨基酚（0.5mM）对Bax mRNA表达的抑制效果，乙酰半胱氨酸浓度在1mM时，能极显著地（P<0.01）增强对乙酰氨基酚（1mM）对Bax mRNA表达的抑制效果，乙酰半胱氨酸浓度在0.5、1mM时，均能极显著地（P<0.01）增强对乙酰氨基酚（0.5、1mM）对Bcl-xL mRNA表达的抑制效果，乙酰半胱氨酸浓度在0.5、1mM时，均能显著地（P<0.05）增强对乙酰氨基酚（0.5-1mM）对Fasl mRNA表达的抑制效果；③脂多糖诱导3h后，细胞中活性的Caspase-3极显著上升（P<0.01）。乙酰半胱氨酸浓度在0.5mM时，能显著地（P<0.05）增强对乙酰氨基酚（0.5mM）对Caspase-3活化的抑制效果；乙酰半胱氨酸浓度在浓度1mM时，不影响（P>0.05）对乙酰氨基酚（1mM）对Caspase-3活化的抑制效果。体内试验：方法：30头健康仔猪（7.98±1.00kg）随机均分为5组，分别设对照组、LPS造模组、AAP组（混饲浓度为600mg/kg）、NAC组（混饲浓度为1200mg/kg）和联合用药组（混饲浓度为600mg/kgAAP+1200mg/kgNAC）。仔猪预饲10d后，按100μg/kg.bw的剂量腹腔注射LPS造成急性免疫应激模型，对照组按相同剂量腹腔注射生理盐水，注射LPS后3h前腔静脉采血，采用RT-PCR方法测定LPS刺激3h后，仔猪外周血单核细胞中Bax、Bcl-xL、Fasl的mRNA表达量。结果：脂多糖注射3h后，仔猪外周血单核细胞中Bax、Bcl-xL、Fasl mRNA表达极显著上调（P<0.01）。乙酰半胱氨酸能极显著地（P<0.01）增强对乙酰氨基酚对Bax、Bcl-xL、Fasl mRNA表达的抑制效果。2.对乙酰氨基酚与乙酰半胱氨酸单用和联用对脂多糖诱导后仔猪的NF-κB信号通路的影响体外试验:方法：将分离后培养的仔猪外周血单核细胞分别设空白对照组、LPS造模组、AAP组（浓度为0.5和1mM）、NAC组（浓度为0.5和1mM）和联合用药组（两药浓度均为0.5和1mM组合），进行药物预处理1h后，再加入终浓度为1μg/mL的LPS，继续培养3和20h后，采用ELISA法测定3h细胞培养上清液中TNF-α及20h的IL-6和IL-10含量；采用RT-PCR方法测定LPS刺激3h后的单核细胞中TNF-α、IL-6和IL-10的mRNA表达量。结果：脂多糖注射3h后，仔猪外周血单核细胞中TNF-α含量极显著上调（P<0.01），乙酰半胱氨酸浓度在0.5mM时，能显著地（P<0.01）增强对乙酰氨基酚（0.5mM）对TNF-α的抑制效果；脂多糖注射20h后，仔猪外周血单核细胞中IL-6和IL-10含量极显著上调（P<0.01），乙酰半胱氨酸浓度在0.5mM时，能极显著地（P<0.01）增强对乙酰氨基酚（0.5mM）对IL-6和IL-10的抑制效果；脂多糖注射3h后，仔猪外周血单核细胞中TNF-α、IL-6和IL-10mRNA表达极显著上调（P<0.01）。乙酰半胱氨酸浓度在0.5、1mM时，均能极显著地（P<0.01）增强对乙酰氨基酚（0.5-1mM）对TNF-α、IL-6和IL-10的mRNA表达的抑制效果。体内试验：方法：采用RT-PCR方法测定LPS刺激3h后，仔猪外周血单核细胞中TNF-α、IL-6和IL-10的mRNA表达量。结果：脂多糖注射3h后，仔猪外周血单核细胞中TNF-α、IL-6和IL-10mRNA表达极显著上调（P<0.01）。乙酰半胱氨酸能极显著地（P<0.01）增强对乙酰氨基酚对TNF-α、IL-6和IL-10mRNA表达的抑制效果。以上研究表明，对乙酰氨基酚和乙酰半胱氨酸对免疫应激仔猪MAPK信号通路和NF-κB信号通路的激活具有抑制作用，乙酰半胱氨酸能增强对乙酰氨基酚的抑制效果。