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目的双酚A(Bisphenol A,BPA)是一种环境内分泌干扰物,广泛应用于人们日用品中。大量实验室研究显示BPA可以损害雄性生殖系统,对雄性生殖发育产生不利影响。目前,BPA暴露引起的生殖功能异常的研究较多集中在青春期或成年期,但关于孕期BPA暴露对子代雄性生殖发育损伤的报道较少。同时,BPA引起的表观遗传变化在男性生殖功能障碍的遗传中起着重要的作用。因此,本研究探讨了孕期BPA暴露对不同发育阶段仔鼠睾丸DNA甲基化的影响,并探讨了仔鼠睾丸中胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)DNA甲基化、基因及蛋白表达水平的改变在BPA致睾丸损伤中的作用,为早期生殖损伤的检测及治疗提供依据。方法1.SPF健康SD雌性大鼠60只,雄性大鼠30只,10周龄。以雌雄2:1比例进行合笼,于次日清晨进行阴道涂片检查,以在显微镜下观察到精子的日期为怀孕0天(GD0)。将受孕成功的50只母鼠随机分为5组,每组10只,于GD5进行灌胃染毒,以5ml/kg容积灌胃染毒至GD19,1次/天,染毒剂量为0.05、0.5、5、50 mg/kg/d,母鼠自然分娩、哺乳后,分别在断乳期(PND21)和性成熟期(PND56)处死雄性仔鼠,以进行相应指标检测。2.观察孕期BPA暴露对PND21和PND56雄性仔鼠的一般毒性情况;通过H&E染色和透射电镜观察BPA对睾丸组织及超微结构的损伤情况。3.使用Real-time PCR法和Western-blot法检测PND21和PND56两个阶段仔鼠睾丸中DNA甲基转移酶(DNMTs)及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的基因和蛋白表达水平。4.利用甲基化特异性PCR法(MSP)检测GDNF的DNA甲基化的表达情况。结果1.孕期BPA暴露对PND21雄性仔鼠睾丸损伤及DNA甲基化的影响(1)检测雄性仔鼠的体重、脏器湿重、脏器系数,发现与对照组相比,各剂量组仔鼠体重均有增加,但只有在0.5 mg/kg剂量组差异具有统计学意义(P<0.05)。肛殖距、肝脏、肾脏和睾丸湿重并无明显差异(P>0.05)。与对照组相比,睾丸脏器系数、肾脏脏器系数无明显差异,仅肝脏脏器系数在0.5 mg/kg剂量组出现显著下降,且差异具有统计学意义(P<0.05)(2)睾丸组织H&E染色结果可见,对照组和0.05 mg/kg BPA组生精小管结构清晰,各级生精细胞排列有序,管腔较多成熟精子,无脱落生精细胞;0.5、5 mg/kg BPA组出现局部管腔扩大、生精细胞层数减少和精子生成减少;50 mg/kg BPA组生精细胞失去了正常排列结构,出现坏死的精子细胞。电镜下观察睾丸组织发现,线粒体在0.05、0.5 mg/kg BPA组未见明显异常改变;而在5 mg/kg BPA组时,镜下可见线粒体脊柱模糊、断脊改变;当剂量为50 mg/kg时,可以明显观察到线粒体脊柱消失。(3)仔鼠睾丸DNA甲基转移酶基因及蛋白表达的检测发现,与对照组比较,DNMT1 mRNA表达水平在5 mg/kg剂量组升高,在50 mg/kg剂量组显著降低,且差异具有统计学意义(P<0.05);DNMT1蛋白表达量在50 mg/kg剂量组显著降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。DNMT3a相对表达水平各剂量组与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,DNMT3b mRNA及蛋白表达水平在0.5 mg/kg剂量组显著升高,且差异有统计学意义(P<0.05)。(4)检测仔鼠睾丸中GDNF的DNA甲基化水平显示,在对照组,0.05、0.5 mg/kg剂量组GDNF基因发生了部分甲基化,而在5、50 mg/kg剂量组GDNF发生了完全甲基化。结果可见,BPA可以引起GDNF基因甲基化水平升高。GDNF基因及蛋白进行检测显示,与对照组比较,GDNF的mRNA表达水平和蛋白表达水平在0.5、50 mg/kg剂量组显著下降,并且差异具有统计学意义(P<0.05)。2.孕期BPA暴露对PND56雄性仔鼠睾丸损伤及DNA甲基化的影响(1)雄性仔鼠一般毒性结果,与对照组比较,5 mg/kg和50 mg/kg BPA组仔鼠体重明显增加,且差异具有统计学意义(P<0.05);肝脏和生殖器湿重在5、50 mg/kg BPA组出现明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05);而肾脏湿重仅在5 mg/kg BPA组升高,且差异具有统计学差异(P<0.05)。在校正体重的因素后,仅肝脏系数在0.5、50 mg/kg BPA组出现升高(P<0.05),其余脏器系数差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)睾丸组织H&E染色结果可见,对照组生精小管结构清晰,各级生精细胞排列有序,管腔较多成熟精子,无脱落生精细胞;0.05 mg/kg BPA组可看到精子细胞有坏死;0.5 mg/kg BPA组生精细胞层数减少,精母细胞数量减少,管腔扩大;5 mg/kg BPA组生精小管管壁变薄,生精细胞层数减少,管腔扩大,可见精子细胞坏死,有精子细胞核固缩和碎裂,可见吞噬大量坏死物质的多核巨噬细胞;50 mg/kg BPA组生精小管萎缩,生精细胞失去正常排列结构,有坏死的精子细胞,管腔完全消失,甚至出现精母细胞大量坏死。(3)仔鼠睾丸DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的基因和蛋白表达水平显示,与对照组相比,DNMT1 mRNA表达水平在0.05 mg/kg剂量组显著升高,而在0.5、5 mg/kg剂量组降低,且差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,DNMT1蛋白表达水平在5 mg/kg和50 mg/kg剂量组下降,且差异具有统计学意义(P<0.05)。0.5、5、50 mg/kg剂量组DNMT 3a mRNA表达水平均低于对照组(P<0.05);蛋白表达水平在5、50 mg/kg剂量组低于对照组,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,DNMT3b mRNA表达水平在0.05、0.5mg/kg剂量组显著升高,而在5、50 mg/kg剂量组显著降低(P<0.05);DNMT3b蛋白表达水平在0.5 mg/kg剂量组显著升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)PND56仔鼠睾丸中GDNF的DNA甲基化水平检测发现,各个剂量组GDNF均发生了甲基化。GDNF基因及蛋白进行检测发现,随着染毒剂量的增加,GDNF mRNA和蛋白表达水平呈下降趋势,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论1.孕期BPA暴露可以导致雄性仔鼠丸损伤,且影响持续到不同的发育阶段。2.孕期BPA暴露可以引起不同时期仔鼠睾丸DNA甲基化异常改变。3.孕期BPA暴露可能通过DNA甲基化异常改变,降低PND21仔鼠睾丸支持细胞GDNF表达水平,引起仔鼠睾丸损伤,危害精子发生,进而可能引起雄性生殖障碍,但在PND56时的影响并不明显。具体机制尚需进一步的研究。