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为了克隆新的水稻耐逆功能基因并加深对水稻逆境反应分子机理的认识,采用基因芯片技术及Affymetrix水稻表达芯片(含51279个转录本)分析了籼稻培矮64S在低温、干旱、高温胁迫下不同生育时期、不同组织器官基因组表达谱的变化,发现水稻各发育时期器官在各逆境条件下其基因组中有406~4560个基因(0.79~8.89%)受逆境诱导而显著上调或下调。用定量实时RT-PCR方法对30个受逆境诱导而表达改变的基因进行了进一步的表达分析,所得结果与基因芯片结果基本吻合,从而验证了基因芯片结果的可靠性。根据基因芯片表达数据、基因的表达模式以及生物信息学分析,从众多受逆境诱导而表达改变的基因中,筛选了2个感兴趣的耐逆候选功能基因,命名为OsMsr1(Oryza sativa L.multiplestresses responsive gene1)与OsCrGtl(O.sativa L.cold responsiveglycosyltransferase-like gene)。
OsMsr1是一个受高温、低温与干旱诱导、在各生育时期与组织器官均显著上调的多逆境应答基因。以培矮64S RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增获得了包含其完整ORF(open reading frame)的cDNA克隆。根据其ORF序列进行预测,该基因编码一个包含89个氨基酸残基的小分子蛋白,理论分子量为9.973kD,pI=5.05;搜索有关数据库,在水稻、玉米、小麦与拟南芥中找到有高相似性的基因,但功能未知,也未发现相同与类似的已知功能的基因保守结构域。对其可能的启动子序列进行分析,发现5个与逆境反应有关的顺式作用元件。为了确认该基因是否具有耐逆功能,构建了pCAMBIA1300-OsMsr1双元表达载体,并通过农杆菌介导法将2×CaMV35S-OsMsr1嵌合基因分别导入水稻93-11与拟南芥中,获得18个独立的T0代转OsMsr1基因cDNA水稻植株与153个独立的T0代转OsMsr1基因cDNA拟南芥植株。对冷胁迫前后T0代转基因水稻叶片净光合速率、光系统Ⅱ光化学量子效率的测定以及对T1代转基因水稻活苗率的测定结果表明:转OsMsr1基因93-11秧苗耐冷性显著强于非转基因的93-11;且在非逆境下,转OsMsr1基因93-11的生长势也显著强于非转基因的93-11,其他农艺性状无显著性差异。对T2代转基因拟南芥纯系的表型鉴定结果表明:虽然在非逆境的正常条件下,其表型与野生型无明显差异,但初步分析结果显示转OsMsr1基因拟南芥对低温、干旱、高盐及高温均比野生型更敏感。
OsCrGtl基因也是一个受高温、低温与干旱诱导、在各生育时期与组织器官均显著上调的多逆境应答基因,但主要应答低温。通过与OsMsr1基因扩增相同的方法获得了包含其完整ORF的cDNA克隆。根据其ORF序列进行预测,该基因编码一个包含462个氨基酸残基的蛋白质,理论分子量为50.327 kD,pI=5.35;搜索有关数据库,得知该基因编码的蛋白质与籼稻、粳稻、玉米及拟南芥编码的糖基转移酶家族蛋白相似,且包含糖基转移酶结构域,因此该基因为类糖基转移酶基因。对其可能的启动子序列进行分析,发现9个与逆境反应有关的顺式作用元件。因此,我们认为该基因为1个新的水稻耐逆候选基因。