研究背景:脑胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤。胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）属于WHOⅣ级脑胶质瘤,恶性程度最高,约占所有脑胶质瘤的45%。由于放化疗效果不佳,且不良反应明显,加之血脑屏障阻碍、肿瘤微环境免疫抑制等因素,靶向及免疫治疗效果受限,GBM患者的术后复发率高,生存时间及生存质量始终难以提升,中位总生存期仅14.6～16.7个月。因此保证GBM术后患者在有限的生存期内获得良好的生存质量非常重要,探寻对放化疗增效、减毒的治疗方法具有重大研究价值。双参散结方是中国中医科学院广安门医院花宝金教授的临床经验方,由西洋参、三七、冬虫夏草菌粉组成,具益气活血之效。前期门诊小样本临床观察显示:相比于单纯西医治疗,双参散结方联合西医治疗在改善GBM术后气虚血瘀型患者临床症状、提高生存质量、缓解不良反应等方面具有一定优势,但缺乏详细的临床数据支撑。髓源性抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）介导的肿瘤免疫抑制微环境是常规疗法对GBM患者治疗效果不佳的一个重要原因。MDSCs在外周淋巴器官内激活扩增后,被招募至GBM肿瘤微环境中,肿瘤微环境中的MDSCs浸润程度越高,免疫抑制越严重,临床治疗效果越差。减少外周MDSCs的激活扩增,从而降低肿瘤微环境中MDSCs的浸润程度,是改善肿瘤免疫抑制微环境的重要方法。PTEN/PI3K/Akt信号通路是促进MDSCs扩增激活的重要通路。课题组前期基础研究表明,双参散结方可以调控以MDSCs为核心的免疫抑制微环境,减少荷瘤小鼠外周脾脏中MDSCs的含量,网络药理学研究亦发现,双参散结方可调控PI3K/Akt信号通路。我们将从MDSCs入手,探讨双参散结方治疗GBM的作用机制。研究目的:1.通过前瞻性临床研究,探索双参散结方改善GBM术后患者生存质量的临床疗效与安全性,为名中医验方防治GBM提供临床证据与数据支撑;2.通过基础研究,借助网络药理学和现代分子生物学技术,观察双参散结方对U87MG胶质瘤荷瘤小鼠外周脾脏MDSCs中PTEN/PI3K/Akt通路的影响,从抑制外周MDSCs激活扩增和减少肿瘤微环境MDSCs浸润的角度,探索双参散结方的作用机制,揭示益气活血法防治GBM的科学内涵,为名中医验方防治GBM提供科学依据。研究方法:1.临床研究:采用前瞻性非随机同期对照研究设计,对2020年9月至2021年11月就诊于中国中医科学院广安门医院和首都医科大学附属北京天坛医院的GBM患者依据纳排标准进行筛选,收集符合条件的GBM患者的基线资料、服药状况、检查资料等信息,填写病例报告表,建立Excel数据库。根据分组标准划分双参散结方组（以下简称双参组）和对照组,运用SPSS22.0软件进行统计分析,评价两组患者治疗前后中医证候积分、生活质量评分、神经功能状态、功能状态、药物安全性方面的不同变化。2.基础研究:（1）通过免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）检测 WHO Ⅱ-Ⅳ 级脑胶质瘤患者肿瘤病理组织内MDSCs表型CD33的表达水平,观察不同级别脑胶质瘤患者肿瘤组织内MDSCs的浸润程度。（2）采用网络药理学的研究方法,应用TCMSP数据库筛选双参散结方的活性成分,Swiss Target Prediction平台预测双参散结方的作用靶点,GeneCards、TTD、OMIM数据库综合筛选GBM的疾病靶点。利用String在线平台,对二者交集的靶点构建蛋白互作网络,筛选关键靶点。使用Cytoscape 3.7.2软件,构建“双参散结方-活性成分-GBM-靶点”可视化网络。通过Metascape在线平台对共同基因进行基因本体论富集（GO）分析及KEGG通路富集分析,探讨双参散结方治疗GBM可能调控的通路。（3）采用U87MG细胞株,接种到BALB/c裸鼠的右侧腋下,建立U87MG胶质瘤荷瘤小鼠模型,用纯净水、替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）、双参散结方联合TMZ干预35天后,观察各组小鼠移植瘤质量,绘制移植瘤体积增长曲线和体重变化曲线,验证益气活血的双参散结方联合TMZ对小鼠GBM的抑制作用。（4）建立U87MG胶质瘤荷瘤小鼠模型,并设置未接瘤的空白组BALB/c小鼠,用纯净水、TMZ、双参散结方联合TMZ干预35天后,采用流式细胞术及免疫荧光染色法检测各组小鼠脾脏及移植瘤组织中的MDSCs,观察双参散结方联合TMZ对MDSCs表型的影响。（5）建立U87MG胶质瘤荷瘤小鼠模型,用纯净水、TMZ、双参散结方联合TMZ干预35天后,采用磁珠分选的方法分选出各组小鼠脾脏MDSCs,Western Blot检测MDSCs中信号通路相关蛋白PTEN、PI3K、Akt、p-Akt的表达水平。研究结果:1.临床研究:（1）本研究共入组GBM术后气虚血瘀型患者60例,脱落5例,28例双参组和27例对照组患者最终完成了研究。两组患者在年龄、性别、体质指数（BMI）、手术部位、肿瘤切除程度、肿瘤数量、MGMT启动子甲基化情况、IDH突变情况等基线资料方面无明显差异,具有可比性（P＞0.05）。（2）中医证候积分:两组基线均衡,治疗后,双参组中医证候量表总分改善情况优于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;症状方面,双参组在头晕目眩、头痛、恶心呕吐、神疲乏力、肢体麻木、震颤、失眠症状方面改善优于对照组。（3）生活质量评分:两组基线均衡,治疗后双参组的生活质量总分高于对照组,差异有统计学意义（P＞0.05）。具体到脑瘤生存质量特异性量表（Fact-Br V4.0）的各模块而言,治疗后双参组的生理状况、社会/家庭情况、情感情况、功能状况评分均高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。（4）神经功能状态评分:我们采用神经肿瘤神经功能评价量表（NANO Scale）评估GBM术后患者的神经功能状态。治疗后,双参组及对照组GBM术后患者神经功能状态均未改善,但双参组患者均保持神经功能状态稳定,未有进展,而对照组患者出现2例进展,差异无统计学意义（P＞0.05）。（5）功能状态评分:我们采用KPS评分量表评估GBM术后患者的功能状态。治疗前两组KPS评分无差异（P＞0.05）,治疗后双参组高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。（6）安全性指标:双参组与对照组在血液系统不良反应、消化系统不良反应、泌尿系统不良反应及不良反应发生率方面,差异均无统计学意义（P＞0.05）。2.基础研究:（1）经IHC法染色后,不同级别脑胶质瘤患者病理组织中CD33的表达存在差异,WHO Ⅱ级脑胶质瘤组织中CD33表达最低,WHO Ⅲ、Ⅳ级脑胶质瘤组织CD33表达明显高于WHO Ⅱ级,差异均具有统计学意义（P＜0.01）。同时,WHO Ⅳ级GBM肿瘤组织中CD33表达高于WHO Ⅲ级,P＜0.01。随着WHO病理级别的升高,脑胶质瘤组织中MDSCs浸润程度逐渐增高。（2）基于网络药理学研究,从双参散结方中筛选出23种活性成分,排名前10的活性成分有罂粟碱、槲皮素、啤酒甾醇、食脂素、花生四烯酸、十八碳二烯、虫草素、乙酸亚油酯、豆甾-7-烯醇、胆固醇棕榈酸酯。双参散结方治疗GBM的关键靶点有 158 个,其中 TP53、SRC、PIK3CA、MAPK3、PIK3R1、MAPK1、AKT1、STAT3、HSP90AA1、VEGFA 是排名前 10 的核心靶点。PI3K/Akt 信号通路、Sphingolipid信号通路、FoxO信号通路、Ras信号通路、Rap信号通路等可能是双参散结方治疗GBM富集的主要通路。结合课题组前期研究,我们提出PI3K/Akt信号通路可能是双参散结方调控GBM患者外周MDSCs激活扩增的重要通路。（3）给药干预35天后,TMZ组与SSG+TMZ组荷瘤小鼠的平均瘤重明显小于Model组,差异具有统计学意义（P＜0.01）,且SSG+TMZ组瘤重最低。从各组荷瘤小鼠移植瘤体积增长曲线来看,相比于Model组和TMZ组,SSG+TMZ组抑制肿瘤生长速度的作用最佳,持续抑瘤效果最好。各组荷瘤小鼠的体重均呈增长趋势,且不同时间点各组荷瘤小鼠的体重变化均无明显差异（P＞0.05）。（4）流式细胞术结果显示,与空白组相比,Model组荷瘤小鼠脾脏MDSCs含量明显增加。给药干预35天后,TMZ组及SSG+TMZ组小鼠脾脏MDSCs含量较Model组明显下降,且SSG+TMZ组脾脏MDSCs下降幅度大于TMZ组。免疫荧光结果显示,TMZ组和SSG+TMZ组肿瘤组织内的CD11b+Ly6C+及CD 11 b+Ly6G+表达较Model组均有所下降,且SSG+TMZ组较TMZ组表达更低。（5）PTEN/PI3K/Akt信号通路是促进外周MDSCs激活扩增的重要通路,给药干预35天后,Western Blot结果显示,与Model组及TMZ组相比,双参散结方联合TMZ可以明显增强荷瘤小鼠外周脾脏MDSCs中PTEN蛋白的表达,抑制 PI3K、Akt、p-Akt 蛋白的表达（P＜0.05）。研究结论:1.相较于单纯西医标准放化疗方案,双参散结方联合西医标准放化疗治疗可有效改善气虚血瘀型GBM术后患者的临床症状和生活质量,稳定患者神经功能状态,提高功能状态,且安全可行。2.双参散结方与替莫唑胺联用能够抑制U87MG胶质瘤荷瘤小鼠移植瘤的生长,抑瘤效果优于单纯替莫唑胺化疗,其抑制肿瘤生长的作用机制可能与减少U87MG胶质瘤荷瘤小鼠外周脾脏中MDSCs 比例,降低肿瘤微环境中MDSCs的浸润程度有关。3.双参散结方减少U87MG胶质瘤荷瘤小鼠外周脾脏MDSCs 比例、抑制MDSCs激活扩增的机制可能与PTEN/PI3K/Akt信号通路有关。