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目的:为探讨辛温解表方和辛凉解表方防治急性上呼吸道感染的作用机制,本课题以寒冷刺激致小鼠鼻黏膜免疫屏障功能低下(mouse nasal mucosal barrier dysfunction,MNMBD)模型为研究对象,从调节鼻黏膜免疫屏障功能入手,考察了辛温解表方的代表方剂麻黄汤及辛凉解表方的代表方剂银翘散的作用,以期明晰辛温、辛凉解表方防治急性上呼吸道感染的科学内涵。方法:1.解表方对MNMBD模型鼻黏膜免疫屏障功能的影响研究1.1麻黄汤对MNMBD模型鼻黏膜免疫屏障功能的影响研究取雄性KM种小鼠随机分为奥司他韦对照组(ASTW+Normal)、麻黄汤对照组(MH+Normal)、正常组(Normal)、模型组(Model)、麻黄汤组(MH+Model)和阳性药组(ASTW+Model)。奥司他韦对照组和阳性药组、麻黄汤对照组和麻黄汤组分别提前灌胃给予磷酸奥司他韦(即40mg/kg)和麻黄汤(即3.51g/kg)2天,1次/天;造模当天,在造模前30min再次灌胃给予相应的药物,其余组灌胃给予蒸馏水。于造模结束后24h,过量麻醉处死小鼠,摘取鼻黏膜组织,采用Western-blot法检测鼻黏膜组织中IgA和IFN-λ的蛋白表达。1.2银翘散对MNMBD模型鼻黏膜免疫屏障功能的影响研究取雄性KM种小鼠随机分为奥司他韦对照组(ASTW+Normal)、银翘散对照组(YQ+Normal)、正常组(Normal)、模型组(Model)、银翘散组(YQ+Model)和阳性药组(ASTW+Model)。奥司他韦对照组和阳性药组、银翘散对照组和银翘散组分别提前灌胃给予磷酸奥司他韦(即40mg/kg)和银翘散(即72.54g/kg)2天,1次/天;造模当天,在造模前30min再次灌胃给予相应的药物,其余组灌胃给予蒸馏水。于造模结束后24h,过量麻醉处死小鼠,摘取鼻黏膜组织,采用Western-blot法检测鼻黏膜组织中IgA和IFN-λ的蛋白表达。2.解表方增强MNMBD模型鼻黏膜免疫屏障的作用机制IFN-λ在上皮细胞产生后与IFN-λ受体结合,通过激活JAK1/STAT1/2信号通路产生具有抗病毒作用的效应分子如粘病毒抗性蛋白(myxovirus resistance protein 1,Mx1)等。本部分造模及药物干预方法同1.1、1.2,采用Western-blot法检测该信号通路中IL-10Rβ、IFNLR1、JAK1、STAT1、STAT2、p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2、IRF9、Mx1的蛋白表达,考察麻黄汤和银翘散对JAK1/STAT1/2信号通路的影响。3.麻黄汤对聚肌胞苷酸(Poly I:C)滴鼻刺激MNMBD模型的影响Poly I:C是双链RNA的人工合成类似物,研究报道其可用模拟病毒入侵引起上呼吸道感染。为考察麻黄汤提高小鼠鼻黏膜免疫屏障后是否能够抵御病毒入侵造成的损伤,故进行本部分研究。3.1 Poly I:C滴鼻刺激对MNMBD模型的影响研究取雄性KM种小鼠随机分为正常组(Normal)、模型组(Model)、Poly I:C+Model组。所有动物于造模前禁食不禁水12h,正常组不予任何刺激,模型组和Poly I:C+Model组将动物置于-20℃环境中1h,再转移入25℃环境中30min,循环两次,正常组和模型组在造模结束后0h缓慢滴鼻PBS,Poly I:C+Model组在造模结束后0h缓慢滴鼻Poly I:C 5μg/μl(按100μg Poly I:C/20μl PBS配制),20μl/只;于造模结束后24h,过量麻醉处死小鼠,摘取鼻黏膜组织,Western-blot法检测鼻黏膜组织中IgA和IFN-λ的蛋白表达。3.2麻黄汤对聚肌胞苷酸(Poly I:C)滴鼻刺激MNMBD模型的影响研究取雄性KM种小鼠随机分为正常组(Normal)、Poly I:C+Model组、麻黄汤组(MH+Poly I:C+Model)和阳性药组(ASTW+Poly I:C+Model)。MH+Poly I:C+Model组和ASTW+Poly I:C+Model组分别提前灌胃给予麻黄汤(即3.51g/kg)和磷酸奥司他韦(即40mg/kg)2天,1次/天;造模当天,在造模前30min再次灌胃给予相应的药物,其余组灌胃给予蒸馏水。复制MNMBD模型,正常组在造模结束后0h缓慢滴鼻PBS,Poly I:C+Model组、MH+Poly I:C+Model组和ASTW+Poly I:C+Model组在造模结束后0h缓慢滴鼻Poly I:C 5μg/μl(按100μg Poly I:C/20μl PBS配制),20μl/只;于造模结束后24h,过量麻醉处死小鼠,摘取鼻黏膜组织,检测指标同3.1。结果:1.解表方对MNMBD模型鼻黏膜免疫屏障功能的影响研究结果显示,麻黄汤和银翘散均可升高MNMBD模型小鼠鼻黏膜组织中IgA和IFN-λ的蛋白表达。2.解表方增强MNMBD模型鼻黏膜免疫屏障的作用机制结果显示,麻黄汤可升高JAK1/STAT1/2信号通路中IFNLR1、p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2、IRF9、Mx1的蛋白表达(P(27)0.05或P(27)0.01);银翘散可升高IL-10Rβ、IFNLR1、p-JAK1、p-STAT1、p-STAT2、IRF9、Mx1的蛋白表达(P(27)0.05或P(27)0.01)。3.聚肌胞苷酸(Poly I:C)滴鼻刺激对MNMBD模型的影响研究结果显示,模型组和Poly I:C+Model组小鼠鼻黏膜组织中IgA的蛋白表达均明显降低(P(27)0.01);模型组小鼠鼻黏膜组织中IFN-λ的蛋白表达低于正常组(P(27)0.05),但Poly I:C+Model组IFN-λ的蛋白表达明显高于模型组(P(27)0.05)。4.麻黄汤对聚肌胞苷酸(Poly I:C)滴鼻刺激MNMBD模型的影响研究结果显示,麻黄汤可升高聚肌胞苷酸(Poly I:C)滴鼻刺激MNMBD模型小鼠鼻黏膜组织中IgA和IFN-λ的蛋白表达(P(27)0.05或P(27)0.01)。结论:麻黄汤和银翘散均可通过提高鼻黏膜组织中IgA和IFN-λ的蛋白表达进而提高MNMBD模型鼻黏膜免疫屏障功能。两个解表方的作用机制均能通过促进IFN-λ的蛋白合成,促进JAK1/STAT1/2信号通路中的JAK1、STAT1、STAT2蛋白磷酸化和升高IFNLR1、IRF9的蛋白表达,进而促进具有抗病毒作用的效应分子Mx1的生成。在受到Poly I:C刺激的条件下,麻黄汤仍然能够提高MNMBD模型小鼠鼻黏膜免疫屏障功能。