第二部分大鼠骨髓单个核细胞的分离、培养和体外扩增目的;探讨大鼠骨髓单个核细胞的提取、分离培养和体外扩增的最佳条件,观察在体外培养时骨髓单个核细胞的生长状况和生物学特性。方法;通过密度梯度离心法从成年大鼠骨髓中分离骨髓单个核细胞,用含15%胎牛血清的低糖DMEM培养扩增;利用贴壁培养法分离纯化,分离出骨髓间充质干细胞,并传代扩增,观察不同培养时间的细胞形态及生物学特性。结果;骨髓单个核细胞培养4天时形成由骨髓间充质干细胞组成的细胞集落;5-12天时,细胞生长迅速,出现较大集落,贴壁生长,成集落生长的细胞生长速度显著快于散在生长的细胞;14天后,细胞融合成单层,排列成漩涡状或放射状。用0.25%胰蛋白酶消化后传代培养,传代细胞增殖较快,约5天可传一代,传至3代时细胞基本纯化,但随着传代次数的增加细胞增殖速度变慢并出现多倍体核型。结论;经密度梯度离心法获取的骨髓单个核细胞内含有较多骨髓间充质干细胞,利用贴壁培养方法可以对骨髓间充质干细胞进行初步纯化。第三部分大鼠急性心肌梗死模型制备的实验研究目的;建立一种稳定可重复的急性心肌梗死动物模型,为后期骨髓单个核细胞移植做好准备。方法;Wistar大鼠20只,随机分为2组,每组10只,经3%戊巴比妥钠麻醉后,实验组开胸结扎左冠状动脉前降支(LAD),对照组仅开胸,不结扎LAD,心电监测观察LAD结扎前后心电图变化,8周后行心脏超声检查及病理组织学检查,检测心梗模型制备的成功率及对心功能的影响。结果;1、试验组心电监测术后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVF导联ST段持续抬高＞4mm;2、术前两组动物心脏超声心动图检查,各项指标均无差异,p＞0.05。术后8周超声心动图检查显示,心梗组收缩期与舒张期心腔内径与对照组相比,LVEDd增加42.9%,差别显著(0.902±0.053 VS 0.631±0.015,p＜0.001);LVESd增加82.5%,与对照组相比,差别显著(0.794±0.054 VS 0.435±0.028,p＜0.001);ESAWTR较对照组相应指标相比,显著减低,分别为(0.085±0.042 VS 0.314±0.057,p＜0.001);而ESPWTR较对照组相应指标相比,则显著增高,分别为(0.594±0.118 VS0.319±0.046,p＜0.01);心梗组与对照组LVEF相比,显著减低,分别为(0.286±0.053 VS 0.670±0.047,p＜0.001)。3、进行了心梗病理组织学检查,HE染色及Masson染色显示缺血部位心肌被纤维结缔组织替代,近心内膜处残留极少量心肌细胞,其余各层内不含有心肌细胞,缺血部位与周围非缺血部位的分界清晰。结论;1.前降支结扎可以造成大鼠前侧壁及下壁大面积心肌梗死,心肌梗死后对心功能影响较大。2.心电图Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVF导联ST段在LAD结扎后持续抬高＞4mm,可以作为前壁大面积心肌梗死的早期判断指标。3.超声心动图检查是观察试验大鼠心脏形态及心功能状态的较理想方法,方便动态观察,便于追踪随访。第四部分同种异体骨髓单个核细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究目的;探讨急性心肌梗死后骨髓单个核细胞移植对心功能的影响、作用机制及骨髓单个核细胞移植的最佳时机。方法;成年近交系Wistar雄性大鼠36只,体重170g-200g,随机抽取10只为对照组(未移植细胞),10只为心梗后立即细胞移植组,10只为心梗1周后细胞移植组,另外留取6只作为骨髓干细胞供体;截取大鼠的双后肢,分离骨髓单个核细胞,用DAPI标记待用,同时荧光显微镜下观察DAPI的细胞标记率,留取部分标记过的BMMNCs进行培养;结扎大鼠前降支,制作心梗动物模型,然后将已经标记的BMMNCs2×10~7个多点注射到梗死区域,分组同上;术后8周行超声心动图检查3组大鼠心脏功能,然后处死大鼠,荧光显微镜下观察DAPI标记的细胞,HE染色组织学检查分析心梗局部毛细血管密度,非心梗区域心肌细胞行细胞调亡TUNEL分析。结果;1.骨髓单个核细胞DAPI标记率为100%,DAPI标记的BMMNCs体外培养能够成活并成功传代。2.术后8周超声心动图检查显示,对照组(心梗未移植组)、心梗后即刻细胞移植组及心梗后1周细胞移植组EF值分别为(0.299±0.044 VS 0.318±0.042 VS0.591±0.092),对照组与心梗后即刻细胞移植组相比,P＞0.05,无统计学意义,对照组及心梗后即刻细胞移植组分别与心梗后1周细胞移植组EF值比较,p值均＜0.001,差别非常显著;前壁收缩末期室壁增厚率(ESAWTR)在对照组(心梗未治疗组)、心梗后即刻细胞移植组及心梗后1周细胞移植组分别为(0.087±0.036VS 0.101±0.020 VS 0.114±0.020),两两比较,P值均＞0.05,无统计学差异,但有增高趋势;后壁收缩末期室壁增率(ESPWTR)在对照组(心梗未移植组)、心梗后即刻细胞移植组及心梗后1周细胞移植组分别为(0.594±0.103 VS0.542±0.092 VS 0.457±0.080),对照组与心梗后即刻细胞移植组之间ESPWTR比较,P＞0.05,无统计学差异,对照组及心梗后即刻细胞移植组与心梗后1周细胞移植组ESPWTR比较,P值均＜0.05,差别显著。3.所有移植过BMMNCs的心脏标本切片中未发现任何细胞核发DAPI的蓝色荧光。4.心梗区域毛细血管数目在对照组、心梗后即刻细胞移植组及心梗后1周细胞移植组分别为(2.14±0.62)VS(2.37±0.74)VS(7.08±1.06),其中心梗未治疗组与心梗后立刻细胞移植组比较,P＞0.05,无统计学差异;心梗未治疗组与心梗后立刻细胞移植组分别与心梗后1周细胞移植组比较,P均＜0.01,差别显著。5.对照组、心梗后即刻细胞移植组及心梗后1周细胞移植组非缺血区域的心肌细胞凋亡率分别为;(0.098±0.028)VS(0.084±0.025)VS(0.046±0.017)。其中心梗未治疗组与心梗后立即细胞移植组比较,P=0.32,无显著差异;而对照组及心梗后立即细胞移植组分别与心梗后1周细胞移植组比较,P值均显著＜0.01,差别非常显著。结论;1.大鼠心肌梗死1周后,骨髓单个核细胞移植可以明显改善梗死后8周大鼠的心脏功能;而大鼠急性心肌梗死后立即骨髓单个核细胞移植对大鼠梗死后8周的心脏功能的影响不大。2.荧光显微镜检查结果提示,心脏功能的改善与骨髓单个核细胞的横向转化关系不大。3.BMMNCs移植可以增加大鼠心肌梗死后8周梗死局部的毛细血管密度,减少心肌细胞的调亡,梗死局部的毛细血管密度的增加及心肌细胞调亡的减少,可能与心功能的改善有关。