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[目的]1.探讨miR-98在膀胱癌细胞中的表达情况,及对膀胱癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响;2.探讨miR-98在膀胱癌细胞中对线粒体动力学、线粒体膜电位变化的影响,并检测miR-98对线粒体动力学相关蛋白表达情况的影响;3.构建LASS2基因3’-UTR不同基因型的质粒,验证miR-98与LASS2基因的靶向结合能力,探讨LASS2对膀胱癌细胞增殖、凋亡和化疗敏感性的影响,以及研究miR-98与LASS2的相互作用关系。[方法]1.通过荧光定量PCR检测不同膀胱癌细胞系(J82、T24、5637、RT4、BIU-87)及正常尿路上皮细胞中miR-98的表达情况;选择高表达及低表达的膀胱癌细胞系分别转染miR-98抑制物及模拟物,进行CCK-8实验、克隆形成实验检测miR-98对膀胱癌细胞增殖能力的影响;利用顺铂或多柔比星处理膀胱癌细胞,CCK-8实验检测miR-98对膀胱癌细胞化疗敏感性的影响,流式细胞术检测miR-98对膀胱癌细胞凋亡能力的影响;2.运用MitoTrackerTM Red线粒体染色及Hoechst 33258细胞核染色,激光共聚焦显微镜观察线粒体形态,检测miR-98对膀胱癌细胞线粒体动力学的影响;利用JC-1染色及流式细胞术检测miR-98对膀胱癌细胞线粒体膜电位变化的影响;运用Western blot实验检测miR-98对线粒体动力学相关蛋白表达情况的影响;3.为了检测LASS2是否为miR-98的直接靶标,首先运用qRT-PCR检测miR-98对膀胱癌细胞中LASS2表达的影响;将具有LASS2野生型(CUACCUC)或突变型(CUAAAUC)3’-UTR结合位点的报道质粒与miR-98模拟物一起转染T24细胞,双荧光素酶报告基因测定检测荧光素酶活性;同时检测LASS2对膀胱癌细胞化疗敏感性和线粒体动力学的影响,在膀胱癌细胞中转染LASS2质粒,利用CCK-8实验检测膀胱癌细胞活性,激光共聚焦显微镜观察线粒体形态,JC-1染色检测线粒体膜电位变化,Western blot实验检测线粒体动力学相关蛋白表达情况;最后检测miR-98在膀胱癌细胞中是否通过LASS2发挥作用,通过T24、T24 mimic细胞中转染LASS2 siRNA,运用Western blot、CCK-8、流式检测细胞相应蛋白表达、化疗敏感性、凋亡变化。[结果]1.与SV-HUC-1细胞系相比,miR-98在所检测的5株膀胱癌细胞系中,有4株癌细胞系表达量更高;选取了显示出最低的内源性miR-98水平的T24细胞以及具有相对高的miR-98水平的BIU-87分别转染miR-98模拟物和miR-98抑制物。CCK-8实验结果发现miR-98抑制物减弱了 BIU-87细胞的增殖能力,而增强miR-98的表达促进了 T24细胞的增殖能力,克隆形成实验检测miR-98对膀胱癌细胞系长期增殖能力的影响,得到了同样的结果。通过CCK-8细胞活力检测测定膀胱癌细胞对顺铂或多柔比星处理的反应,结果发现,与对照组相比,在顺铂和多柔比星处理48和72小时后,miR-98增强可以使T24细胞的细胞活力增强,而减弱miR-98的表达则下调了膀胱癌细胞BIU-87的细胞活力。流式细胞术检测化疗药物处理24小时后膀胱癌细胞早期和晚期细胞凋亡的变化发现,降低miR-98的表达可以诱导BIU-87细胞发生细胞凋亡,而miR-98表达增多则降低了 T24细胞的凋亡情况;2.激光共聚焦显微镜观察到增强miR-98的表达,可以促进线粒体分裂为点状,而抑制miR-98的表达,会使BIU-87细胞中的线粒体更容易于融合为线状或杆状;使用流式细胞术进行定量分析发现,在具有miR-98抑制物的BIU-87细胞中,线粒体膜电位下调,在T24细胞中增高miR-98的表达后线粒体膜电位增高;另外检测线粒体分裂相关蛋白表达变化的结果发现增高miR-98的表达上调了cyclin D1,p-Drp1,Drp1和Fis1蛋白,同时下调了 LASS2蛋白的表达,而miR-98抑制物则是降低了 cyclin D1,p-Drp1,Drp1和Fis1的蛋白表达,同时上调了LASS2的蛋白表达。3.检测了 miR-98对膀胱癌细胞中LASS2 mRNA表达的影响,结果发现miR-98表达增强显著抑制了 LASS2mRNA的表达;双荧光素酶报告实验发现在转染了miR-98模拟物及野生型LASS2 3’-UTR的T24细胞中荧光素酶强度被抑制,而在用突变质粒转染的细胞中荧光强度未发现显著变化;在BIU-87和T24细胞中转染了 LASS2质粒增强两株细胞中LASS2的表达水平,LASS2过表达可以抑制膀胱癌细胞增殖,提高膀胱癌细胞对顺铂的敏感性,LASS2过表达还诱导了两种膀胱癌细胞中线粒体趋于融合,降低了线粒体膜电位,抑制了 Drp1磷酸化和总Drp1蛋白的表达;利用向T24细胞中转染LASS2 siRNA来敲低T24细胞中LASS2的表达,同时转染miR-98的模拟物,结果发现在用LASS2 siRNA转染的细胞中,miR-98模拟物对p-Drp1/Drp1的作用被削弱,CCK-8及流式细胞术结果也发现,用LASS2 siRNA及miR-98 mimic处理的T24细胞对顺铂的化疗敏感性调节不显著,LASS2敲低削弱了 miR-98对T24细胞的凋亡抑制作用。[结论]1.miR-98在膀胱癌细胞系中表达上调,同时能够促进膀胱癌细胞的增殖能力,抑制膀胱癌细胞的凋亡,并能降低膀胱癌细胞对顺铂和多柔比星的化疗敏感性;2.miR-98的高表达增加了线粒体分裂,抑制△Ψm降低,影响线粒体动力学及线粒体凋亡途径,可能通过p-Drp1和Fis1表达上调引起;miR-98作为线粒体功能的调节因子,在膀胱癌细胞中抑制线粒体凋亡;3.miR-98可以抑制LASS2 mRNA及蛋白的表达水平,LASS2作为miR-98的直接靶标,使miR-98与LASS2 3’-UTR直接结合,miR-98通过靶向和下调LASS2影响膀胱癌细胞增殖、凋亡及降低膀胱癌化疗敏感性,并且miR-98可以通过靶向LASS2调节线粒体分裂融合及线粒体膜电位的变化。