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非洲菊(Gerbera)是世界五大切花之一,也是重要的盆栽花卉。由于各种病毒、微生物的侵害使非洲菊的品质受到严重影响,有必要利用各种育种方法培育抗性好的优良品种。
转基因技术是对植物进行定向遗传改良的有效途径,也是研究基因功能的重要手段。尽管非洲菊转基因工作国际上已有报道,但多以叶柄直接出芽的方式获得再生转基因植株,而以非洲菊叶柄愈伤出苗再生植株难度大,不同品种、不同外植体、不同培养条件之间存在巨大差异,严重制约了植物基因工程技术在非洲菊中的应用。
本论文的研究的目的就是针对非洲菊在利用遗传转化技术进行育种方面的问题,以非洲菊切花品种Sunanda试管苗幼叶的带叶叶柄为材料,致力于建立高效、稳定的非洲菊叶柄愈伤再生体系,并在此基础上进行农杆菌介导的遗传转化体系的研究。主要结果如下:
1.建立了高频的叶柄愈伤出苗的非洲菊再生体系。研究了愈伤诱导和分化培养基中的不同植物生长调节剂的种类和浓度、不同生理时期的叶柄、不同无菌苗继代培养基等因素对叶柄愈伤诱导及分化的影响。结果表明:外植体在附加不同植物生长调节剂浓度的培养基上诱导出的愈伤组织在形态和分化能力上存在显著差异。叶柄基部诱导出再生植株能力较强的II类愈伤组织的最适培养基是MS+TDZ0.3 mg L-1+NAA0.1 mg L-1,最适外植体是叶片(含叶柄)长度在0.5-1.5 cm之间,叶片已伸展的颜色嫩绿的幼叶的叶柄,最佳外植体来源的无菌苗继代培养基是MS+KT1.0 mg L-1,再生植株能力较强的II类愈伤组织的诱导率最高达65.9%,此类愈伤在分化培养基MS+6-BA2.0 mg L-1+NAA0.1 mgL-1上能分化出芽并同时进行愈伤组织增殖,分化率达87.4%,在同种分化培养基上第2次继代培养时愈伤分化率可提高至95%。在愈伤诱导培养基中附加AgNO3(0.5-10 mg L-1),对愈伤诱导起抑制作用,AgNO3浓度为0.5 mg L-1时,与不加AgNO3的对照相比,愈伤诱导率低,但诱导出的愈伤分化率略高,在分化培养基加入AgNO3(0.5-10 mg L-1),对愈伤的分化均表现出抑制作用。附加适宜浓度的的CuSO4(1.6-3.2 mg L-1)对愈伤诱导以及分化有促进作用,但未达到显著水平。相对于光培养,暗培养8-20 d对叶柄的愈伤诱导没有显著影响。不定芽在生根培养基为1/2MS+IBA0.6 mg L-1上,生根率100%,试管苗移栽成活率达97%以上。
2.通过GUS瞬时表达对转化条件进行了初步优化。用非洲菊的带叶叶柄和愈伤作侵染材料,通过GUS瞬时表达对不同侵染菌液、菌液浓度、AS使用浓度、侵染时间、共培养时间等转化条件进行了初步的优化,结果表明将非洲菊的带叶叶柄放入经AAM培养基活化、OD600值为0.6-0.8的农杆菌液EHa105/pCAMBIA1305.1中侵染15 min,在含AS200μM的共培养基MS+TDZ0.3 mg L-1+NAA0.1 mg L-1上共培养3 d,带叶叶柄的叶片部分的GUS基因的瞬间表达率最高,可达80%,但是在本研究中,在各种不同的转化条件下,在带叶叶柄的叶柄部分以及愈伤组织上几乎都不能检测到GUS的瞬时表达,如何提高叶柄和愈伤组织的瞬间表达有待进一步研究。