论文部分内容阅读
目的探讨DNA聚合酶δ催化亚基基因(DNA polymerase delta catalytic subunit gene 1, POLD1)及其编码蛋白P125在原发性肝癌中的表达及意义,同时探讨p53对POLD1的调控模式,并观察氯化两面针碱对肝癌细胞中调控POLD1通路的干预作用。方法选用原发性肝癌患者手术切除标本20例,分别采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和western blot法检测POLD1基因表达,同时分析POLD1基因产物- P125蛋白与临床特征的相关性。设计合成针对p53基因的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA),并构建pGPU6/GFP/Neo-p53 shRNA重组质粒。分别将PGPU6/GFP/Neo-p53 shRNA、无关序列对照质粒pGPU6/GFP/Neo-NC shRNA、真核表达载体pEGFP-p53和空载体pEGFP-C1转染至SMMC-7721细胞,G418抗性筛选,获得阳性克隆。MTT法测定生长曲线,克隆形成实验观察细胞的增殖,RT-PCR法及western blot法分别检测POLD1的mRNA及蛋白表达。运用SELDI技术对NC作用后SMMC-7721的蛋白组学进行研究。NC处理SMMC-7721细胞,采用MTT法和克隆形成实验观察细胞的增殖,RT-PCR法和/或荧光定量PCR及western blot法分别检测POLD1调控通路中各调控基因的表达和蛋白表达情况,并采用RNA干扰技术对其进行验证。结果与癌旁组织相比,肝癌组织中POLD1基因表达明显升高(0.70±0.34compared with 0.37±0.23, P<0.05);其编码蛋白P125表达与POLD1基因表达一致,在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织(0.63±0.19 compared with0.39±0.21,P<0.05)。P125蛋白的阳性表达率与肿瘤大小和临床分期有关(P<0.05),而与HBV是否感染、性别及年龄无明显关系(P>0.05)。p53低表达细胞系中的POLD1基因及蛋白P125表达比转染无关序列shRNA细胞系明显升高,而p53高表达细胞系中的POLD1基因及蛋白P125表达比转染空载体的细胞系降低。采用MTT法检测p53低表达细胞系和p53高表达细胞系的生长规律,p53低表达细胞系的生长速度明显比对照组快,而p53高表达细胞系的生长速度慢于对照组。稳定转染pGPU6/GFP/neo-p53 shRNA的SMMC-7721细胞的集落较大,局部集落间呈汇合形式,且集落数目多于对照组；相反,稳定转染pEGFP-p53的SMMC-7721细胞的集落数少于转染空载体的细胞,集落形成能力明显下降。NC处理SMMC-7721后筛选出有统计学意义的差异表达蛋白质峰14个,这些差异蛋白主要跟信号转导、细胞凋亡、细胞周期、代谢、免疫、转录、DNA复制及修复等通路有关。与阴性对照相比,NC作用SMMC-7721细胞后POLD1 mRNA的表达无明显变化。但0.3mg/L NC可明显降低SMMC-7721细胞P125表达水平,而0.15mg/L NC对SMMC-7721细胞P125的表达没有显著性差异。与阴性对照组比,NC明显提高p53 mRNA表达(P< 0.01).0.3～2.4mg/L NC均能不同程度的上调P53蛋白表达水平,其中0.3～0.6mg/L NC上调p53表达水平显著性差异相似(P<0.05),1.2mg/L和2.4mg/L NC与0mg/L NC相比显著性差异水平为P<0.01,结果与mRNA表达吻合。值得注意的是,0.15mg/L NC对P53蛋白表达水平不但不上调,而且还呈现下调趋势,这与该浓度NC上调p53 mRNA表达不吻合。结合NC对P125的表达结果,0.15mg/L NC对P125并无抑制作用,0.3mg/L NC上调P53,继而抑制P125表达。说明有可能存在其他调控因子影响p53 mRNA的翻译,这一现象值得我们继续深入研究。1.0mg/L NC处理p53显性失活的SMMC-7721细胞,p53 mRNA表达明显高于未处理的模型组7721-p53i,但并未回复到原有水平,表明1.0mg/L NC可诱导p53上调。NC作用SMMC-7721细胞48h后,不同程度的影响P21蛋白表达,其中2.4mg/L (P<0.01)和1.2mg/L (P<0.05) NC明显上调P21蛋白表达。有意思的是,0.5,0.3,0.6mg/L NC对肝癌细胞中的P21蛋白并无明显作用,但0.3,0.6mg/L NC却能明显上调细胞中的P53蛋白。因此我们进一步检测了p21 mRNA的表达情况。Real-time PCR结果显示,1.2和2.4mg/L NC对p21 mRNA表达明显增强(P<0.01),但0.6mg/L NC对p21 mRNA表达无明显影响,将NC浓度降至0.3mg/L或0.15mg/L, p21 mRNA表达反而降低。在p53干扰的SMMC-7721细胞中,p21mRNA表达明显降低,表明细胞存在正常的p53-p21途径。p53干扰的SMMC-7721细胞经1.0mg/L NC处理48h后,p21 mRNA表达显著性升高,甚至高于p53显性细胞组。不同浓度NC可不同程度地上调C-myc、E2F、CyclinD和RB-1,其中0.15、0.3mg/L NC对C-myc和CyclinD的上调及0.15mg/L NC对E2F的上调均有显著性差异(P<0.05),0.6mg/L NC对E2F、CyclinD的上调和0.15～0.6mg/LNC对RB-1的上调均有极显著性差异(P<0.01),但0.3mg/L NC对C-myc、E2F的作用与对照组比无显著性差异,但呈上调趋势。与对照组相比,0.15、0.3mg/L NC显著性下调CyclinE mRNA表达(P<0.05),但0.6mg/L NC对CyclinE mRNA的表达不降反升。0.15～0.6mg/L NC对CDK4 mRNA的表达与对照组相比均有显著性下调作用(P<0.05)。0.15～0.6 mg/L剂量范围内对细胞的抑制作用呈现浓度和时间依赖性。光学显微镜观察细胞形态,发现在NC作用过程中,细胞形态逐渐变得不规则,大部分细胞贴壁不良,出现皱缩、变圆、脱落死亡,且随着浓度增加,死亡细胞增多。集落形成实验结果显示,NC(0.15,0.30,0.60mg/L)处理细胞10d后,细胞克隆大小及集落形成率随药物浓度增大而减小。NC可明显提高G2/M期的细胞比例,使S、G0/G1期的细胞比例减少。NC处理组的细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01),凋亡率随浓度增大而增高,也呈现出浓度依赖性。结论原发性肝癌与POLD1基因表达有关,检测其蛋白产物P125有利于判断肝癌的恶性程度。POLD1的表达受p53的抑制。肝癌细胞的增殖及集落形成能力随着p53表达波动的原因可能与p53的存在一定程度上抑制了POLD1的表达,使DNA复制受阻有关。NC在一定浓度范围内可剂量、时间依赖性抑制肝癌细胞增殖。NC阻滞了细胞周期G2/M期,诱导细胞凋亡。NC通过依赖和非依赖p53途径共同诱导p21上调,从而阻滞细胞周期；通过上调p53抑制P125表达,使DNA复制因缺乏DNA复制主要酶DNA复制酶δ的催化亚基而受到抑制；p53、RB-1、C-myc、E2F、CyclinD、CyclinE、CDK2、CDK4共同完成NC诱导的细胞凋亡。