玉米芽尖遗传转化体系的创建及EβF合成酶基因的转化

来源 :河南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jizhidong2009
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玉米是主要的粮食作物之一,在国民经济中占有重要的地位。蚜虫是玉米生产过程中一种重要的害虫,在玉米生育期内都会遭受蚜虫的危害,对玉米产量构成很大威胁。因此,如何有效地控制蚜虫危害,是玉米生产中面临的一个重要问题。目前,在玉米种质资源中缺乏有效的抗蚜虫基因,而通过转基因技术创制玉米抗蚜虫新种质显得尤为重要。反-β-法尼烯(EβF)是大多数蚜虫警报信息素的主要成分,对蚜虫有较强的驱避作用,同时对蚜虫的天敌(瓢虫,食蚜蝇,草蛉)有很强的吸引性,从而有较强的抗蚜效果。EβF合成酶基因是植物体内催化法尼基焦磷酸(FPP)合成EβF的关键酶基因。目前该基因已从多种植物中得到分离和鉴定。本研究以欧洲薄荷为材料,分离克隆了EβF合成酶基因,构建了植物表达载体,以玉米种子萌发后的芽尖生长点为受体,利用农杆菌介导法将EβF合成酶基因成功转入了玉米中。试验结果如下:(1)用PCR方法从薄荷中扩增EβF合成酶基因全长,测序后将其连接到载体pFGC5941上,获得了植物表达载体pFGC5941-EβF。(2)通过农杆菌介导法,将构建的植物表达载体pFGC5941-EβF转化玉米种子萌发后的芽尖生长点,并对转化条件进行了研究。结果显示,农杆菌侵染液浓度OD600值为0.6、共培养时间2 h、真空处理10 min,是玉米芽尖生长点遗传转化的合适条件。(3)玉米遗传转化中,不同基因型材料的遗传转化率不同。本试验选用5个玉米优良自交系(郑58,昌7-2,齐319,郑22,87-1)和一个杂交种(郑单958)作为转化受体材料,进行转化率的比较研究。对T0代转化幼苗进行PCR检测,不同材料的转化率差异较大。在选取的6个材料中,郑单958的遗传转化率最高达5.36%,郑58次之,为5.29%,而昌7-2的转化率最低仅为0.91%,6个基因型的平均转化率为3.07%。(4)试验过程中利用3种不同的方法检测了转化率情况,对T0代幼苗进行除草剂筛选,得到的除草剂筛选阳性率为2.96%;T1代幼胚进行GUS染色,得到的GUS基因表达率为2.1%;T1代植株取叶片进行PCR分子检测,得到的PCR检测阳性率为1.91%。(5)感受态受体细胞是农杆菌转化的一个必要条件。本研究的创新点在于选用浸泡后处于露白时期的玉米芽尖生长点作为转化受体,其转化原理可能是露白时期的种子处于刚萌发状态,对外界因子的作用十分敏感,胚性细胞开始处于分裂状态,子叶对胚芽的包裹不再严密,此时利用农杆菌侵染,将有利于转化的实现。(6)本试验选用玉米芽尖生长点作为转化受体,采用农杆菌介导法将EβF合成酶基因转入玉米中,为利用EβF合成酶基因创制玉米抗蚜新种质探索了一条新途径。
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