背景胰腺癌一般指发生于胰腺外分泌部的恶性肿瘤,以胰腺导管腺癌多见。其病情发展迅速,死亡率极高,五年生存率不足5%,是威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤。在我国,每年大概有30-40万新发病例,且其发病率有上升趋势。据流行病学统计资料显示,吸烟、肥胖、糖尿病和慢性胰腺炎是胰腺癌的常见危险因素。目前,诊断胰腺癌的手段有限,临床主要通过检测血液中的糖链抗原19-9(Carbohydrate antigen19-9,CA19-9)的含量进行筛查。然而,因为CA19-9的敏感性和特异性相对较低,在慢性肝炎和慢性胰腺炎等消化道疾病中也常出现异常表达。而且在明确诊断为胰腺癌时病人往往已处于晚期,常发生神经浸润和远处转移,失去最佳治疗时机。此外,尽管目前治疗胰腺癌的手段多样,包括手术、化疗和放疗等,但是其效果仍较差,死亡率依然居高不下。目前对胰腺癌的发生发展过程中的分子机制研究还处于探索阶段,虽取得了一些进展,但尚未完全阐明。一般认为,与胰腺癌有关的发病因素大致可分为环境因素和遗传因素两大类。导致胰腺癌发病的常见基因突变有KRAS、SMAD4、TP53和CDKN2A等。其中,KRAS基因异常是胰腺癌已知最常见的基因异常,存在于80%-90%的病例中。其次,大约有50%的胰腺癌病例存在TP53突变,而CDKN2A和SMAD4的突变概率为20%左右。这些突变往往涉及体内大量信号转导途径中蛋白质分子的改变,从而导致或促进胰腺癌的发生、发展。上述常见的基因改变能在一定程度上阐明胰腺癌发病的生物学机制,但由于体内基因表达受到转录、翻译等多个环节的调控,单纯的基因改变难以全面阐明胰腺癌发病的潜在分子机制。因此,探究胰腺癌的发病机制需要寻找新的突破口,以便更全面地了解胰腺癌的发病机制,从而设计相应的药物遏制胰腺癌的发展。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,Lnc RNA)是一类转录序列大于200bp的RNA,不能编码蛋白质。在过去的十年间,大量的Lnc RNA通过测序等手段被发现,而它们在体内的功能尚有待阐明。目前,Lnc RNA已被证明广泛参与体内多种生物学过程,且某些Lnc RNA处于关键的环节。更重要的是,Lnc RNA不像m RNA及其相应的蛋白产物的表达具有广泛性,大部分Lnc RNA只在相应的器官中的特定生理阶段表达,这为临床诊断和治疗疾病(包括肿瘤)提供了新的方法、策略及可能的作用靶分子。近十年来,大量研究发现Lnc RNA与多种疾病的发病和进展密切相关,包括恶性肿瘤。之前的研究发现Lnc RNA与多个部位的恶性肿瘤发病存在相关性。Lnc RNAMALAT-1被证明与非小细胞肺癌早期阶段的病情存在相关性;Lnc RNA PCA3在前列腺癌中的表达含量明显增高;Lnc RNA H19与胃癌的发病相关。在胰腺癌中,相关的Lnc RNA研究揭示了在其发病过程中,一系列的Lnc RNA及相关的m RNA的表达发生改变,但只有少数几个Lnc RNA的具体功能得到研究。如位于HOX基因附近的Lnc RNA HOTAIR在胰腺癌的发病过程中对HOX的表达调控与正常生理情况不同,从而改变肿瘤细胞的增殖和侵袭能力,促进癌症的发生。鉴于以上研究背景及研究现状,我们在设计课题时提出假设:能否通过测序发现一系列在胰腺癌中表达异常的Lnc RNA,并从中挑选相关的Lnc RNA作为临床标志物,发掘其可能的诊断价值及预测预后的临床意义,从而为胰腺癌的临床诊治提供指导和参考。目的本课题的主要目的是通过测序技术筛查在胰腺癌发病过程中表达异常的Lnc RNA,在基因芯片测序结果的基础上挑选出异常表达的Lnc RNA,用大量临床组织样本对测序结果进行q PCR实验验证。同时通过细胞学实验探究特定Lnc RNA在胰腺癌发病中的潜在分子机制,从而揭示其在胰腺癌发病过程中的分子生物学功能。方法1.采用基因芯片技术对临床收集的10个(5对)胰腺癌及邻近的癌旁组织的Lnc RNA及相关m RNA的含量进行检测。2.根据芯片技术测定的结果进行Gene Ontology(GO)富集分析及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析。3.利用q RT-PCR技术对表达异常的Lnc RNA含量进行检测,对比癌组织与癌旁组织的Lnc RNA含量差异,并与病人临床病理特征进行相关性分析。4.选取人胰腺癌细胞株As PC-1、PANC-1、MIA Pa Ca-2、CFPAC-1和Bx PC-3,检测特定Lnc RNA在细胞株中的表达情况。5.选取PANC-1和As PC-1细胞系作为研究对象,通过构建过表达和干扰重组质粒等方法建立体外模型,并通过CCK-8实验检测细胞增殖,Transwell方法测定细胞侵袭迁移。6.采用流式细胞仪检测经质粒转染特定Lnc RNA过表达或干扰序列的细胞株PANC-1、As PC-1,分析细胞周期是否发生变化。结果1.通过基因芯片技术检测5对胰腺癌及癌旁组织的33045个Lnc RNA及30215个相关m RNA发现,共有4364个Lnc RNA表达发生改变(变化倍数≥2.0,P<0.05),其中包括2365个Lnc RNA发生上调,1999个Lnc RNA下调。此外,3857个相关m RNA表达量增加,1005个相关m RNA表达量下降。2.GO分析表明上调的相关m RNA中,与蛋白质功能(如蛋白定位,蛋白酶体复合物和大分子物质在胞内的定位)关系最为密切。下调的相关m RNA,与物质在胞内的运输,细胞色素C从线粒体中释放和胞膜受体关系有关。KEGG分析表明共有42条信号通路与上调的相关m RNA有关,8条信号通路与下调的相关m RNA有关。3.与癌旁组织相比,胰腺癌组织中Lnc RNA CTD-2244C20.1,RP11-263F15.1和LOC541471的表达改变具有明显统计学差异(P<0.05)。4.Lnc RNA RP11-263F15.1与胰腺癌的分化程度具有相关性(P<0.05),其对胰腺癌的诊断效能为0.843(95%CI=0.774-0.911,P<0.001)。此外,Lnc RNA RP11-263F15.1高表达的病人预后相对较差,其总体生存期为12.0个月,显著低于Lnc RNA RP11-263F15.1低表达的病人(25.1个月)(P<0.001)。5.体外实验中,Lnc RNA RP11-263F15.1过表达的细胞株其增殖和侵袭迁移能力明显提高且能细胞周期中S期细胞的比例明显提高,而Lnc RNA RP11-263F15.1敲减后的细胞株其增殖和侵袭迁移能力明显下降且S期细胞的比例显著降低。结论在胰腺癌的发病和进展过程中,一系列的Lnc RNA和相关m RNA的表达含量发生改变。其中,Lnc RNA CTD-2244C20.1,RP11-263F15.1和LOC541471在胰腺癌中的表达量改变明显。Lnc RNA RP11-263F15.1对胰腺癌的诊断效率为0.843,且与胰腺癌的分化有关,其表达高的病人预后相对较差。Lnc RNA RP11-263F15.1过表达能增强胰腺癌细胞株的增殖和侵袭迁移能力并提高S期细胞的比例。Lnc RNA RP11-263F15.1有望成为胰腺癌新的肿瘤标志物,为研究和诊治胰腺癌提供了新的途径和思路,具有潜在的临床诊断和预测预后的意义。