论文部分内容阅读
α-半乳糖苷酶是一类可以催化水解含有α-半乳糖苷键物质的酶类,因此被应用在饲料、食品等领域用来降解α-半乳糖苷类抗营养因子,该酶广泛地分布在植物,动物和微生物中,现已筛选出不少产α-半乳糖苷酶活性高的微生物菌株,并进行了广泛深入的研究。本论文从多种食用菌的子实体中检测到α-半乳糖苷酶,以高活性的α-半乳糖苷酶的食用菌的子实体和发酵液作为研究对象,提取出子实体和发酵液中的α-半乳糖苷酶,并研究其酶学性质及对寡糖类物质的降解效果,同时研究具有α-半乳糖苷酶活性的菌糠作为饲料的可行性。论文的主要研究结果如下:综合运用各种纯化手段,从鸡枞菌子实体中提纯一种α-半乳糖苷酶,该酶是一种分子量为72 kDa的单亚基蛋白,纯化倍数为146倍,比活为3135 U/mg。该酶作用底物pNPG的最适pH为5.0,在酸性条件下稳定性好,最适反应温度为60℃,较耐热,在60℃下孵育2小时,相对酶活保持在90%以上。重金属离子Cd2+和Hg2+对酶活性有强烈的抑制作用,化学修饰剂NBS的修饰结果表明色氨酸(Tryptophan)是该酶活性中心的必需基团。通过薄层色谱和DNS法检测鸡枞菌α-半乳糖苷酶对棉籽糖类家族的降解效果,6小时内可以将10 mg/mL的寡糖混合物完全降解为半乳糖和蔗糖,故此酶可以应用在食品和饲料中用于去除棉籽糖类胀气物质,有利于人和动物的健康。由于鸡枞菌不能人工栽培,菌丝体也较难培养,选取另一种子实体中含有α-半乳糖苷酶的食用菌作为研究对象,研究其发酵液中产酶的情况,经过筛选,当豆饼粉添加到发酵培养基中时,可以诱导云芝发酵液中产生α-半乳糖苷酶,通过正交试验,对云芝产α-半乳糖苷酶的发酵条件进行了优化,最终确定了云芝发酵产酶的最佳培养基组成为豆饼粉2%,半乳糖1%,MgSO40.1%,KH2P040.05%,发酵条件为250mL三角瓶中装入50mL的培养基,26℃/180rpm,培养时间为7天。从该发酵液中纯化出该α-半乳糖苷酶,该酶的分子量70kDa, FPLC和SDS-PAGE的共同结果表明该酶是一个单亚基蛋白,反应的最适pH为3.0,耐酸,最适反应温度为60℃,温度低于50℃时活性稳定。Pb2+和Fe3+对酶活有强烈的抑制作用,浓度越高,抑制作用越明显,Cd2+,Cu2+, Hg2+对该酶的活性也有20%-50%的抑制作用,其他离子对酶活的影响不明显。云芝发酵液对瓜尔豆胶有非常好的降解效果,这是发酵液中各种降解酶协同作用的结果。以玉米芯为主要碳源,豆饼粉既为氮源又为诱导物进行云芝和平菇的栽培,云芝为液体接种,平菇原种接种,研究食用菌菌糠中α-半乳糖苷酶的变化,并对其作为饲用的安全性进行评价。添加豆饼粉的平菇子实体和菌糠中α-半乳糖苷酶的活性都高于未添加豆饼粉的平菇子实体和菌糠中酶的活性,而且未出菇的云芝菌糠中α-半乳糖苷酶的活性可以达到303 U/g。平菇菌糠和云芝菌糠中均未检测到黄曲霉毒素B1,重金属汞、镉、氟、铅、砷的含量也都达到国家饲料卫生标准的要求。以上实验结果表明,食用菌子实体和发酵液中的α-半乳糖苷酶耐酸耐热,性质稳定,对半乳糖苷类物质有很好的降解效果,并且添加豆饼粉的平菇菌糠和云芝菌糠中也有高活性的α-半乳糖苷酶活性,尤其是平菇作为一种大量栽培的食用菌,每年菌糠的产量非常高,可以作为饲料或饲料添加剂,既能提高饲料的利用率,又能提高动物的消化能力,而且又避免菌糠的大量丢弃。