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盐生杜氏藻Dunaliellesalina(简称盐藻)是迄今为止世界上发现的最耐盐的真核光合生物,而甘油是盐藻用于调节细胞内外渗透压变化的关键调渗物质。依赖NAD+辅酶的3-磷酸甘油脱氢酶(GPD,ECl.1.1.8)是盐藻甘油代谢途径中的关键酶。因此,对该基因的功能研究在植物抗逆性和甘油工程菌的构建方面都将发挥极其重要的作用。本文预测,盐藻Osm-GPD可能同时具有3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)与3-磷酸甘油磷酸化酶(GPD)双活性,且这一特点与盐藻极其耐盐的特性相关。为证实提出的预测,本文从基因和蛋白水平上分别对盐藻Osm-GPD特殊基因结构进行功能研究。
第一,成功建立盐藻GPD和GPP的活性测定方法,比较不同盐浓度下两者活性变化的差异。
第二,在mRNA水平上研究Osm-GPD基因在盐藻中的表达的情况。
第三,盐藻Osm-GPD基因不同结构域基因片段的克隆。
第四,gpd1.1和gpd1.9基因片段的原核表达及纯化。构建大肠杆菌表达载体pET-GPD1.1和pET-GPD1.9,转入大肠杆菌BL21中表达,通过Ni亲和层析进行一步纯化。
第五,盐藻Osm-GPD天然蛋白的westernbloting分析。利用GPD1.1和GPD1.9重组蛋白分别制备两者的多克隆抗体,再对盐藻天然蛋白进行蛋白质印迹分析。
第六,通过功能互补实验,体内验证GPD1.1和GPD1.9的功能。构建酿酒酵母表达载体pRS-GPD1.1和pRS-GPD1.9,通过电转化分别转入缺陷GPD1的酿酒酵母W303-1A缺陷株中,分别检测两种重组菌对缺陷型细胞耐盐、耐渗生长的互补效果。