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研究背景子宫内膜异位症(Endomitriosis,EMT)是育龄期妇女常见疾病,是具有活性的子宫内膜腺体和间质组织出现在子宫腔被覆内膜及子宫肌层以外,并具有生长、浸润及反复出血等特点,临床常表现为周期性的腹痛加剧和不孕,症状显著者可影响患者生活质量。子宫内膜异位症为雌激素依赖性疾病,孕激素因能够通过对子宫内膜的生长和功能的调控作用抑制异位内膜细胞的生长而被应用于临床治疗。但是,黄体功能不全及孕激素抵抗现象存在于子宫内膜异位症患者,导致患者不孕、流产率增高,并对大剂量孕激素治疗反应差。研究表明,正常子宫内膜在黄体期主要由孕激素所主导,而在子宫内膜异位症中,这种孕激素的主导作用则被孕激素抵抗和雌激素主导作用所代替,通过纠正孕激素抵抗可以提高疾病的治疗效果。姜黄是我国传统中药,属活血化瘀药,为姜科植物姜黄的干燥根茎,是临床常用药,其性辛温,味苦,无毒,归肝、脾经,具有活血行气,通经止痛的作用,主治气滞血瘀的痛症和风湿痹痛。在妇科应用中主要用于妇女血瘀经闭,产后瘀停腹痛,跌扑损伤,痈肿和气滞血瘀的胸腹痛、痛经等。相关动物实验研究表明,姜黄能够抑制大鼠异位内膜的生长,使异位组织体积缩小,而且姜黄素能够调节大鼠的孕激素受体PR的表达情况。在临床治疗中,中医药对于本病的治疗更多的是专方专药,并且具有一定的优势,因此探讨中药对内异症的作用机制有重要意义。本实验通过蛋白免疫印迹实验及酶联免疫吸附剂测定法,检测姜黄素对内异症中相关信号水平的影响,旨在探讨姜黄素对子宫内膜异位症的作用机制,为子宫内膜异位症的治疗提供新的思路。研究目的探究姜黄素对AMPK/IGFBP1信号的表达调控及其对子宫内膜异位症孕激素敏感性调控的机制研究方法分别采用细胞单独培养和共培养的方式,利用Western blot和RT-qPCR实验首先检测子宫内膜异位症异位内膜和正常内膜间质细胞中AMPK、pAMPK、PR和IGFBP1的蛋白表达和mRNA水平和腺上皮细胞的HSD17β2的蛋白表达;通过姜黄素对子宫内膜异位症异位间质及腺上皮的刺激再次检测相关蛋白、mRNA的水平,探讨姜黄素的作用机制。结果1.使用波形蛋白抗体及角蛋白抗体通过免疫细胞化学方法鉴定细胞来源及纯度见图一。2正常子宫内膜、在位内膜和异位内膜中pAMPK、IGFBP1、PR的蛋白表达水平情况见图二。如图2所示,异位内膜间质细胞pAMPK、IGFBP1、PR的蛋白水平与正常内膜及在位内膜间质小包相比明显降低(P<0.05),而正常内膜与在位内膜间质细胞的相关蛋白水平则无显著差别(P>0.05)。3.姜黄素对内异症IGFBP1的mRNA水平的影响见图三。与正常子宫内膜间质相比,异位内膜间质细胞IGFBP1的mRNA表达水平显著降低,通过姜黄素的刺激其表达水平明显升高(P<0.001)。4.姜黄素、甲羟孕酮影响异位间质细胞中pAMPK、IGFBP1、PR的蛋白表达情况见图四姜黄素与甲羟孕酮均能促进相关蛋白的表达水平的表达,二者联用效果显著(P<0.05)。5.腺上皮细胞单独培养体系中各组HSD17β2蛋白表达情况见图五在腺上皮单独培养体系中,与空白对照组相比,姜黄素组、甲羟孕酮组、二者联用组的HSD17β2蛋白表达水平均无明显改变(P>0.05)。6.腺上皮与异位间质细胞共培养体系中各组HSD17β2蛋白表达情况见图六在共培养体系中,与空白对照组相比,姜黄素组、甲羟孕酮组、二者联用组的HSD17β2蛋白表达水平均有提高,二者联用组效果显著(P<0.05)。结论及意义1.姜黄素通过AMPK信号通路调控子宫内膜异位症间质细胞中IGFBP1的表达及分泌。2.姜黄素可通过激活AMPK/IGFBP1信号通路促进子宫内膜异位症间质细胞中孕激素受体(PR)的表达,从而可能逆转存在于子宫内膜异位症中的孕激素抵抗。3.姜黄素在子宫内膜异位症间质细胞中诱导的IGFBP1分泌蛋白与IGF1竞争结合,阻断了IGF1与腺上皮细胞表面IGFR1的结合,最终促进了腺上皮细胞内HSD17β2的活性,从而可能逆转孕激素抵抗导致的高雌激素水平及病灶生长。姜黄素通过AMPK/IGFBP1信号通路调控子宫内膜异位症中异位间质细胞与腺上皮细胞间的异常相互作用、逆转存在于子宫内膜异位症中的孕激素抵抗,从而抑制病灶的生长,为子宫内膜异位症发病发展机制探索提供新的思路及实验基础,并为姜黄素在子宫内膜异位症治疗中的潜在意义提供理论实验基础。