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荒漠昆虫小胸鳖甲(Microdera punctipennis)是新疆准噶尔盆地的拟步甲科特有种，属于避冻型昆虫，对小胸鳖甲低温转录组数据库分析发现一个超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）基因上调表达，该抗氧化酶除了具有抗氧化防御作用外，是否能在低温环境胁迫时发挥作用，值得深入研究。 本研究以小胸鳖甲cDNA为模板，克隆得到MpSOD基因，利用RT-PCR进行低温表达谱分析，并利用大肠杆菌和酵母表达系统，对MpSOD蛋白抗冻和抗氧化的功能进行验证，利用过氧化氢敏感性鉴定了MpSOD的类型，免疫组化分析确证了MpSOD在小胸鳖甲幼虫脂肪体中的表达，具体结果如下： 1、小胸鳖甲超氧化物歧化酶基因的克隆与低温表达谱。以小胸鳖甲cDNA为模板克隆获得超氧化物歧化酶基因，MpSOD。生物信息学分析表明，MpSOD包含600bp的开放阅读框，编码199个氨基酸，理论分子量为22kD，包含FeSOD和MnSOD保守的N端FGSGWAW域和C端DVWEHAYY域，将其编码蛋白命名为MpSOD。实时荧光定量PCR结果显示，在4℃与-4℃冷胁迫时，MpSOD的mRNA水平均呈现上升-下降-上升的应激反应趋势，其中4℃处理3h和11h后，MpSOD的mRNA水平分别为对照组的48.8倍和69.2倍；-4℃胁迫7h和11h后，为对照组的7.5倍和7.8倍，表明MpSOD是冷响应基因，对小胸鳖甲应对低温胁迫可能发挥作用。 2、MpSOD的原核表达与抗氧化抗低温功能验证。将MpSOD构建至pET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选出阳性克隆BL21(pET32a-MpSOD)，优化诱导表达条件，获得可溶性蛋白。Western blot印迹显示，重组蛋白Trx-His-MpSOD正确表达。利用浸蘸H2O2的纸片扩散实验验证MpSOD蛋白的抗氧化功能，测量抑菌圈直径结果显示，对照菌BL21(pET32a)的抑菌圈直径大于实验菌BL21(pET32a-MpSOD)。10mM和40mM的H2O2处理后，对照菌的抑菌圈直径分别是实验菌的1.4倍和1.2倍。生长曲线法检测重组菌的氧化胁迫耐受性，结果显示在50 mM，100 mM，200 mM的H2O2处理后，实验菌的生长优于对照菌，表明实验菌中异源表达的MpSOD有助于细胞抵抗H2O2的危害。酶活性测定结果表明，实验菌的超氧化物歧化酶酶活性是对照菌的1.6倍，说明融合蛋白具有超氧化物歧化酶活性。实验菌与对照菌在-4℃、-7℃、-18℃的生长曲线结果显示，实验菌的生长优于对照菌。-7℃胁迫处理后观察菌落形态，结果显示实验菌的菌落密度均大于对照菌，说明Trx-His-MpSOD可以赋予大肠杆菌BL21(pET32a-MpSOD)抗冻性。 3、利用真核表达系统进行MpSOD蛋白的功能研究。将MpSOD构建至pYES2载体上并转化酿酒酵母(INVSCⅠ)，获得实验菌 INVSCⅠ（pYES2-MpSOD），以载体pYES2的转化菌INVSCⅠ（pYES2）作为对照菌，利用半乳糖诱导外源蛋白MpSOD的表达。氧化胁迫实验表明，添加5mM H2O2的培养基中，对照菌生长迟缓，而实验菌所受影响较小；-7℃低温胁迫实验菌与对照菌的生长曲线表明，实验菌的生长优于对照菌；菌落计数结果显示，-7℃胁迫10d实验菌是对照菌的1.3倍，胁迫17d是对照菌的1.7倍，胁迫20d后对照菌几乎停止生长，实验菌是对照菌的3倍，表明酵母表达的MpSOD可提高其胁迫耐受性。 采用核酸免疫小鼠制备MpSOD蛋白的特异性抗体，获得MpSOD的小鼠抗血清，效价为1:50000，用此抗体进行Western blot检测INVScⅠ(pYES2-SOD)裂解液，表明酵母中的外源蛋白已正确表达。酶活性测定表明，实验菌的过超氧化物歧化酶活性是对照菌的2.4倍（P<0.05）。 4、SOD同工酶FeSOD和MnSOD的鉴定。用大肠杆菌和酵母表达的SOD分别进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用MnSOD对H2O2不敏感而FeSOD敏感的特性，在染液中添加H2O2，结果显示，原核和真核表达的MpSOD都出现了清晰透明的SOD活性条带，说明MpSOD蛋白对H2O2不敏感，可判定为MnSOD。提取小胸鳖甲幼虫的总蛋白，用制备的抗MpSOD血清进行Western印迹检测，结果显示在44kD处出现了特异的抗原-抗体免疫反应条带，其大小约为预期条带的2倍，表明该抗体能与小胸鳖甲的MpSOD蛋白特异性结合。免疫组化结果显示，小胸鳖甲脂肪体内存在大量MpSOD蛋白。