轮状病毒(Rotavirus, RV)是世界范围内引起5岁以下婴幼儿病毒性肠胃炎的最主要病原体。RV根据VP6特异性可分为7个组(A-G),造成人类婴幼儿腹泻的主要是A组轮状病毒。全球每年有超过1亿患儿因感染RV导致腹泻,200万需要住院治疗,其中约50万因严重腹泻而死亡。至今还没有治疗轮状病毒感染的特效药物,疫苗仍然是预防和控制轮状病毒感染,减少重症死亡病例的最有效途径。目前已有多个国家和地区使用疫苗预防RV感染,获批上市的疫苗Rotateq, Rotarix及罗特威均属于减毒活疫苗,这三种疫苗的使用为减少轮状病毒腹泻的患病和死亡发挥了重要作用。由于选用的毒株不同,加之不同地区自然条件、经济状况的差异以及母乳中可能存在的抗体等因素使活疫苗的有效性受到一定程度影响。另外,活疫苗制备中的外源因子污染、可能引起的不良反应(如肠套叠)和潜在的毒力返祖风险也是活疫苗在安全性上存在的问题。因此,在尚未获得完全安全有效的疫苗前选择合适的毒株研制不同形式的疫苗还是非常必要的。以往研究RV基因工程疫苗主要选择编码结构蛋白VP7和VP4的基因作为目的基因。VP7和VP4蛋白具有很好的免疫原性和特异性,但VP7、VP4在不同型RV中存在较大差异,且随着病毒在自然界或人体的循环也易产生基因的漂移和变异,从而可能影响到免疫原的特异性和免疫的有效性。本课题利用RV基因组中变异性小,高度保守的一个多功能非结构蛋白NSP4,与具有良好特异性和免疫原性的外壳蛋白VP7结合,构建可同时表达NSP4和VP7的双顺反子重组腺病毒疫苗,并在小鼠上对其免疫原性和保护效果进行评价。重组腺病毒疫苗的构建及体外表达产物检测。以源于流行区的G1P[8]型轮状病毒ZTR-68株基因组RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增NSP4和VP7基因,并顺序将获得的VP7和NSP4基因克隆至含有2个多克隆位点的真核载体pcDNA3.0BA。随后以得到的pcDNA3.0BA-NSP4-VP7质粒为模板,PCR扩增含有NSP4和VP7基因以及2基因间的BGHpolyA和CMV启动子序列的基因片段(NSP4-polyA-CMV-VP7),将NSP4-polyA-CMV-VP7亚克隆至腺病毒穿梭载体pshuttle-CMV中,构建含有2个基因表达盒的双顺反子穿梭质粒pshuttle-NSP4-VP7。再通过穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183中发生同源重组获得pAd-NSP4-VP7重组质粒。线性化的pAd-NSP4-VP7转染Ad293细胞后包装生成具有感染性的重组腺病毒rAd-NSP4-VP7。同时构建表达单基因的重组腺病毒rAd-VP7和rAd-NSP4。在电镜下可观察到3种重组腺病毒颗粒的典型形态,通过间接免疫荧光、Western blot等方法可检测到NSP4和VP7基因在Vero细胞中的转录和表达。实验动物免疫及疫苗免疫原性评价。将3种重组腺病毒rAd-NSP4-VP7、 rAd-NSP4、rAd-VP7传代后以肌注和滴鼻的方式免疫ICR小鼠。3种重组腺病毒均不同程度地诱导产生了血清IgG、IgA抗体和肠道SIgA抗体,且血清抗体均具有对ZTR-68株RV的中和活性,rAd-NSP4-VP7和rAd-VP7免疫组的中和保护效果相对更为显著。通过流式细胞术分析免疫小鼠脾淋巴细胞中CD4+、CD8+及CD69+亚群的构成比情况,结合ELISPOT检测]IFN-γ、IL-4细胞因子的分泌,证明3种重组腺病毒也诱导产生了有效的细胞免疫应答,以rAd-NSP4-VP7和rAd-NSP4免疫组的效果更为显著。乳鼠的攻毒及保护性效果评价。通过将不同株RV口服接种BALB/c和ICR乳鼠后观察检测乳鼠腹泻和排毒的情况,建立了Wa(G1P[8]型)和ZTR-68株RV感染乳鼠的动物模型。通过对ICR孕鼠进行rAd-NSP4-VP7重组腺病毒疫苗免疫,再对新生乳鼠进行攻毒,攻毒后新生乳鼠的粪便病毒检出率明显降低,证实了rAd-NSP4-VP7疫苗的免疫保护作用。本研究阐述了可同时表达NSP4和VP7的双顺反子重组腺病毒rAd-NSP4-VP7的构建过程,并证实重组疫苗rAd-NSP4-VP7具有良好的免疫原性,可以同时诱导机体产生包括体液免疫、细胞免疫及粘膜免疫几个方面较为全面的免疫应答反应,且对乳鼠在攻毒后的排毒有显著的保护效果。研究同时还通过比较rAd-NSP4-VP7双顺反子疫苗与rAd-NSP4、rAd-VP7单基因重组腺病毒的免疫效果差异,为NSP4、 VP7蛋白协同表达作为新型轮状病毒疫苗的开发研究提供了实验依据和有益探索。