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萝卜(Raphanus sativus L.),十字花科萝卜属一、二年生草本植物,染色体数2n=2x=18,是一种原产中国的重要蔬菜作物。多倍体育种能够提高作物产量,改善品质和抗性,作为中间桥梁促进植物遗传进化。新型微管抑制剂氨磺灵(Oryzalin作为秋水仙素的替代品也可以抑制有丝分裂后期纺锤丝的形成,从而实现细胞内染色体加倍,同时还可以弥补秋水仙素诱导存在的弊端。对于Oryzalin诱导萝卜染色体加倍的效果、四倍体萝卜育性降低的机理以及不同倍性萝卜基因表达的研究还未见报道。本研究以二倍体萝卜‘Nau-DY’和(’)Nau-ZQH’为试材,利用生长点滴定法和浸种法,对Oryzalin和秋水仙素诱导萝卜染色体加倍的效果进行比较;利用多倍体普遍存在的早期形态和细胞学特征对诱变植株进行初步筛选,染色体计数法最终确定植株倍性,为萝卜四倍体的高效诱导和倍性鉴定提供理论依据;采用常规制片法对四倍体植株花粉母细胞减数分裂的异常现象进行观察;通过mRNA差异显示技术,进行不同倍性萝卜差异表达基因的分离鉴定,以期为解析多倍化的分子遗传机制提供理论依据。研究结果如下:
以‘Nau-DY’和‘Nau-ZQH’两种不同基因型的萝卜为材料于两叶一心时进行滴定处理。以清水和0.1%秋水仙素处理分别为对照,同时对以上两个不同基因型的萝卜品种于早9点和晚4点各滴定1次连续3天,研究不同浓度Oryzalin(0.01,0.02,0.04,0.06mM)诱导萝卜染色体加倍的效果。结果表明,在处理的2个萝卜品种中均得到了同源四倍体,并以0.04 mM的浓度处理得到的加倍效果最好:诱变率分别为30%(Nau-DY)和26.67%(Nau-ZQH),高于秋水仙素诱变效果16.67%和23.33%。经过不同浓度诱导剂浸泡,有些根尖表现加粗且根毛增多的现象,但是移栽到基质中却不能成活。本实验以染色体计数法最终确定植株的倍性,发现四倍体中染色体数目为二倍体的2倍。
以诱导加倍的同源四倍体及其对应的二倍体萝卜为材料,观察花粉母细胞减数分裂过程,用荧光染色法对它们的花粉原位萌发和花粉管伸长过程进行研究。结果表明:四倍体花粉粒整齐度差,并出现干瘪花粉粒且萌发率低;花粉管伸长较慢且不整齐;花粉母细胞在减数分裂各个时期均出现不同程度的染色体异常行为。这些因素均从不同程度上影响四倍体萝卜的育性。
在二倍体和同源多倍体植物中,某些基因表达时可能表现出等位基因的剂量效应,包括一些与植物生长发育和抗性相关的调节基因。本实验采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术,分离萝卜二倍体‘Nau-ZQH’及其同源四倍体差异表达的基因。共分离到24条差异片段,其中19条与已知或推定功能基因高度同源,其中有17条片段在四倍体中表达上调,结果表明多倍化发生的同时诱导一系列基因快速响应表达,如转录因子、表达调控子、胁迫响应和以及参与细胞代谢、脂类代谢、光合作用的基因。