食管癌(esophageal careinoma, EC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一,具有高侵袭性和高转移倾向等生物学行为特点,其浸润、转移是导致患者死亡的主要原因。食管癌分布具有鲜明的地理区域特点,中国是食管癌的高发区,而河南省是中国的高发省份。近年来,由于手术技术的改进、术前新辅助治疗的开展、同步放化疗的应用以及循证医学研究方法的推广,使得食管癌患者的生存期虽然明显延长,生活质量也有一定的改善,但目前食管癌术后五年生存率仅为20-35%,其疗效尚不令人满意。因此,深入探讨食管癌的浸润转移机制,进而提高食管癌的诊疗水平,已成为肿瘤学研究的热点之一。TPX2 (targeting protein for Xklp2靶蛋白),又称repp86 (restricted expressed proliferation-associated protein 86),是一种受细胞周期严格调控的核增殖相关蛋白,参与细胞有丝分裂的纺锤体微管功能。体内、外实验均表明TPX2过表达导致细胞中心体扩增,出现DNA异倍体及多倍体,而肿瘤的发生与细胞增殖失控以及细胞凋亡调节紊乱密切相关,推测TPX2可能在食管癌的发生及进展中发挥作用,有关TPX2在食管癌中的表达及其与食管鳞癌浸润转移关系的研究,国内外尚未见文献报道。为了解TPX2基因与食管鳞癌发生、发展和浸润转移的关系,寻找早期检测食管鳞癌发生和浸润转移的指标及抑制食管鳞癌发生和浸润转移的有效方法,本文采用免疫组化SP法和RT-PCR等分子生物学技术,对食管鳞癌、不典型增生及正常食管黏膜组织等新鲜手术切除标本中的TPX2 mRNA和蛋白表达水平进行检测,探讨与食管癌疾病进展的关系。应用RNA干扰技术,利用化学合成的针对TPX2的siRNA并用脂质体将其转染入EC9706细胞,采用免疫组化SP法、western blot, RT-PRC、细胞增殖抑制实验MTT法、TUNEL技术和流式细胞技术,观察转染后EC9706细胞TPX2基因表达与肿瘤生长、细胞增殖,细胞凋亡和细胞周期变化,运用Boyden chamber侵袭实验观察转染前后细胞体外侵袭力的改变。最后又在建立裸鼠移植瘤模型的基础上,采用RT-PCR、免疫组织化学等技术检测了TPX2在裸鼠移植瘤中的表达,对比观察了RNA干扰对裸鼠移植瘤生长的影响。系统地从体内、外两个方面探讨了TPX2在食管鳞癌组织中的表达及其对浸润转移的影响,为食管癌的靶向基因治疗提供新的思路和理论依据。1.食管鳞癌、癌旁不典型增生及正常食管粘膜组织中TPX2的表达采用免疫组织化学以及RT-PCR检测62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管粘膜组织中TPX2蛋白及mRNA的表达并进行形态学观察。结果发现TPX2蛋白阳性表达主要定位于癌细胞的胞核内,在正常食管粘膜组织、癌旁不典型增生组织和食管鳞癌组织中的表达水平依次逐渐升高,阳性率分别为4.8%、51.6%、85.5%,三组间比较差异有统计学意义(P<0.05),并且TPX2蛋白的表达与淋巴结转移和浸润深度有关(P<0.05),而与食管癌的组织学分级无关(P>0.05)。RT-PCR结果显示正常食管上皮中TPX2 mRNA不表达或者弱表达,在食管癌组织中阳性表达率为65%,不典型增生癌旁组织中阳性表达率为35.5%。食管癌组织中TPX2的表达显着高于不典型增生组织及正常上皮组织(χ2=20.037,P<0.001)。TPX2在癌旁不典型增生组织及癌组织中mRNA的含量分别为0.627±0.084、0.879±0.046,组间比较有明显差异(F=13.999,P<0.05),而且表达水平与食管癌的浸润和转移相关(P<0.05)。但是TPX2蛋白或mRAN表达均与食管癌患者的性别、年龄、大体类型及肿瘤发生部位无关(P>0.05)。2.RNA干扰对食管癌EC9706细胞株TPX2基因表达沉默的效果利用化学合成的siRNA转染食管癌EC9706细胞,用脂质Lipofectamine 2000作为siTPX2的转染介质,将EC9706细胞株分为空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组。空白对照组不予任何处理,阴性对照组加入包含非特异核昔酸序列的质粒,干扰组加入实验筛选出的最有效干扰siRNA进行转染。转染后24h、48h、72h、96h应用RT-PCR和Western Blot方法检测各组TPX2 mRNA及蛋白的表达。采用四甲基偶氮哇盐光吸收法(MTT法)检测EC9706细胞活力,荧光显微镜进行细胞凋亡的形态学检测,绘制各组细胞的生长曲线以观察siTPX2基因对细胞增殖能力的影响,采用TUNEL标记技术观察转染前后细胞凋亡的数量变化,用流式细胞技术观察细胞转染后细胞周期的变化,并采用Boyden chamber实验计算各组穿膜的细胞数以比较转染siTPX2基因对细胞侵袭能力变化的影响。结果显示,转染siTPX2后24h、48h、72h、96h,EC9706细胞TPX2 mRNA以及蛋白的表达量与空白对照组和阴性对照组比较均显着降低,且在72h最明显。EC9706细胞的生长曲线在转染siRNA后48h其增殖特性开始受到抑制,72h抑制作用最为明显,而阴性对照组和空白对照组的细胞生长曲线较为接近未受明显影响。TUNEL技术检测细胞凋亡发现转染siRNA后细胞凋亡数明显增多,与空白对照细胞组和阴性对照细胞组比较有统计学意义(P<0.05),流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化,发现在转染后72h细胞分裂受到抑制,G1期细胞减少而S期细胞增多,细胞周期阻滞在S期。Boyden chamber体外侵袭实验结果显示,siRNA细胞组穿越Matrigel的细胞数显着减少(P<0.05),而阴性对照组及空白对照组之间则无明显差异(P>0.05)3. TPX2 siRNA对裸鼠体内移植瘤生长的影响分别将EC9706细胞组、阴性对照组(无关siRNA细胞组)和siRNA干扰组的食管癌细胞株EC9706注入裸鼠皮下,观察裸鼠移植瘤的成瘤时间及成瘤率,比较各组裸鼠成瘤大小并应用RT-PCR和免疫组织化学方法检测各组裸鼠肿瘤组织中TPX2的mRNA和蛋白表达。结果发现EC9706细胞组、阴性对照组裸鼠移植瘤体积显着大于siRNA干扰细胞组裸鼠移植瘤体积,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05),而且TPX2蛋白及mRNA表达显著高于siRNA干扰组的表达,组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。4.人TPX2基因的分子克隆及真核表达载体的构建用pQE-70-TPX2原核表达载体为基础,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出人TPX2基因；限制性内切酶SphI和BamHI双酶切PCR产物和pcDNA3.1质粒,然后用T4 DNA Ligase连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,PCR验证转化子,挑取阳性克隆扩大培养,提取其质粒,进行SphI和BamHI双酶切验证,并经酶切鉴定,DNA序列证实获得的TPX2基因测序及BLAST分析证明克隆的人TPX2基因序列正确,成功构建了TPX2基因的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,为进一步的研究TPX2的生理功能和与其相关基因的关系奠定了基础。结论1.首次发现,TPX2蛋白及mRNA在食管不典型增生组织及食管鳞癌组织中呈高表达,且与食管癌的浸润程度和淋巴结转移有关,TPX2可能为肿瘤发生与转移的早期指标。2.体外实验表明,siRNA转染细胞组可抑制EC9706细胞TPX2蛋白及mRNA的表达,抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力,将肿瘤细胞阻滞在S期并诱导肿瘤细胞凋亡。3.体内实验显示,siRNA干扰明显降低裸鼠移植瘤TPX2基因表达量抑制肿瘤的增长。4.成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,为下一步转染人食管癌细胞,筛选稳定细胞株,继续研究TPX2的生物学功能、与其他相关基因关系和靶向治疗奠定了基础。