温度是鱼类最重要的环境因子,冷应激是鱼类生活史中常见的现象且对鱼类的繁殖、生长、运动甚至存活都有着较大的影响。除此之外,冷应激也是目前水产养殖产业中重要的威胁之一,但是目前关于鱼类冷应激的耐受机制的研究并不完善。为了进一步探究鱼类冷应激耐受相关的生理学机制,为水产养殖产业提供参考,本论文围绕着“短期饥饿提高斑马鱼冷应激的耐受性”这一表型,通过转录组分析、基因敲除、qPCR分析、Western blot分析、电镜、组织切片、同位素示踪等技术和多种营养学与药理学的调控方法的使用,对饥饿提高鱼类冷应激耐受的作用和调控机制进行了系统而深入的探究。最终发现脂肪分解代谢、降低氧化应激、自噬是饥饿提高鱼类冷应激抗性的重要的生理机制,而且mTOR通路的抑制是饥饿激活这些生理功能的重要的调控机制。论文的主要内容和结论总结如下:1饥饿提高斑马鱼的冷应激耐受及机制初探不同于高等的哺乳动物在遭受冷应激时会增加食物的摄入和产热来维持体温,鱼类在冷应激下会出现减少甚至停止摄食的行为。在哺乳动物中的研究已经表明适度的饥饿可以通过调节能量代谢和降低氧化应激等机制提高机体的抗逆能力和延缓机体衰老。为了探究饥饿在鱼类抵抗冷应激的过程中的作用,我们首先检测了不同时长的饥饿对斑马鱼冷应激耐受的影响,发现超过48小时（2天）的饥饿能够显著提高斑马鱼在冷应激下的存活率。然后我们利用转录组学分析技术对饥饿提高冷应激耐受的机制进行了初步分析,发现饥饿处理除了显著改变细胞损伤的通路之外,还对能量代谢相关通路的表达有着较大的影响,这些结果说明饥饿提高冷应激耐受可能与降低细胞损伤和改善能量代谢有关。为了进一步确定饥饿是通过何种能量底物来调节能量代谢的,我们又分析了饥饿期间斑马鱼对能源物质的利用情况,结果发现,斑马鱼在饥饿初期（24小时内）主要利用糖类供能,在2-4天的饥饿期间主要利用脂肪供能,短期饥饿期间并不利用蛋白质来供能。UCPs是帮助哺乳动物抵抗冷应激的重要蛋白,我们也对其在斑马鱼应对饥饿和冷应激过程中的作用进行了初步分析,发现冷应激或者饥饿对斑马鱼的UCPs表达的激活表现为瞬时性和无规律性,说明UCPs可能不参与饥饿诱导的斑马鱼冷应激的机制。本章的研究结果表明,适宜饥饿可能通过改善能量代谢和降低细胞损伤来帮助斑马鱼抵抗冷应激,而且从营养物质的利用情况来看,脂肪是最有可能的能量供应的来源。2饥饿通过诱导脂分解代谢提高斑马鱼的冷应激耐受糖类和脂肪都是机体重要的能量来源,而且都能被斑马鱼在短期饥饿期间分解利用。为了探究饥饿在冷应激下改善鱼类的能量代谢的机制,我们分别对糖类利用效率和脂肪利用效率在鱼类抵抗冷应激过程中的作用进行了探究。首先,使用葡萄糖替代饲料中的淀粉作为饲料糖源后,斑马鱼在正常温度下利用糖类的效率显著升高,但是在冷应激下的糖利用效率、能量供应效率和斑马鱼的存活率不但没有升高,反而都有所下降,这说明斑马鱼在冷应激下不倾向于利用糖类来供能。在此之后,我们又开展了两个改变斑马鱼脂肪利用效率的实验来验证脂肪利用与冷应激耐受之间的关系。在代谢调节剂实验中,脂肪分解代谢激活剂Fenofibrate的使用促进了斑马鱼脂肪分解代谢的效率,提高了斑马鱼的冷应激耐受;与之相反,脂肪分解代谢抑制剂Mildronate的使用抑制了斑马鱼脂肪分解的效率并降低了斑马鱼的冷应激耐受能力。在不同的脂肪酸饲料试验中,因为斑马鱼利用18:2脂肪酸的效率最高,所以投喂富含18:2脂肪酸的饲料相对于其他处理组显著提高了斑马鱼利用脂肪供能的效率,也提高了斑马鱼在冷应激下的存活率。这两个实验说明提高机体的脂肪利用效率可以提高斑马鱼的冷应激的抗性。最后,我们又通过构建脂肪酸β氧化(CPT1b^-/-)缺陷型的斑马鱼品系对脂肪分解代谢在饥饿提高冷应激耐受过程中的作用做进一步验证,CPT1b敲除后显著降低了斑马鱼的脂肪酸β氧化效率和其抵抗冷应激的能力,进一步的比较分析发现饥饿所诱导的冷应激耐受在CPT1b敲除后也显著降低,这说明脂分解受阻会降低饥饿提高的冷应激耐受。综合上述结果,我们认为:脂肪的分解利用是鱼类应对冷应激的主要供能途径,也是饥饿提高鱼类冷应激耐受的重要机制。3饥饿通过降低机体氧化应激水平提高斑马鱼的冷应激耐受氧化应激会对细胞造成很多直接或者间接的损伤,是机体损伤甚至死亡的重要原因之一。之前的鱼类中研究也发现冷应激会引起鱼类组织中氧化应激,而饥饿在很多其他的物种中都可以降低机体的氧化应激,所以我们假设饥饿可以通过降低氧化应激而提高斑马鱼的冷应激耐受性。首先我们发现急性冷应激会导致斑马鱼肝脏中氧化应激水平随着温度的降低和应激时间的延长持续升高,而饥饿可以降低低温诱导的氧化应激。之后,我们分别在细胞和活体水平上探究了机体氧化应激水平冷应激耐受的影响。细胞实验中,过氧化氢会诱导ZFL细胞中的氧化应激并降低其冷应激耐受,而抗氧化剂维生素C的添加可以显著降低由过氧化氢诱导的氧化应激,并缓解氧化应激所诱导的细胞凋亡和冷应激不耐受。在活体实验中,抗氧化剂硫辛酸和还原型谷胱甘肽的投喂会显著提高斑马鱼的抗氧化酶的表达和活性,降低冷应激所诱导的氧化应激,并提高斑马鱼在冷应激下的存活率。综合本章结果,我们认为:降低机体氧化应激可以增加斑马鱼的冷应激抗性,且饥饿可能通过降低机体的氧化应激水平来提高鱼类的冷应激耐受。4饥饿通过诱导自噬提高斑马鱼的冷应激耐受自噬是机体清除细胞损伤提高各种应激抗性的重要机制,而且饥饿在很多物种都可以诱导自噬的发生。但是自噬在饥饿提高鱼类冷应激耐受过程中的作用还不清楚,我们在细胞水平和活体水平开展了三个实验对这个问题进行了探索。在细胞实验中,自噬激活剂雷帕霉素的添加显著激活了细胞内的自噬水平,降低了细胞的损伤,进而提高了细胞的冷应激耐受;而自噬抑制剂氯喹（CQ）的添加则抑制了自噬的发生,增加了细胞损伤并且降低了细胞的冷应激耐受。在活体实验中,饲料中添加CQ同样会降低斑马鱼的自噬水平,增加其在冷应激下的损伤,并且降低其冷应激耐受。之后,我们通过敲除自噬相关基因ATG12进一步对自噬是否参与饥饿所诱导的冷应激耐受进行了验证。ATG12的敲除显著降低了斑马鱼的自噬功能和冷应激耐受能力,而且由饥饿所提高的冷应激耐受能力也出现显著下降,这说明自噬缺陷会降低饥饿诱导的冷应激耐受能力。总而言之,斑马鱼的自噬水平与其冷应激抗性密切相关,自噬过程在饥饿提高鱼类冷应激耐受的过程中有着不可或缺的中作用。5 mTOR通路参与饥饿对斑马鱼的冷应激耐受性的调控mTOR通路是细胞内感知能量和营养信号,调控多种细胞功能的核心通路。在很多物种的研究都发现,mTOR通路不仅可以被饥饿抑制,脂肪代谢、自噬和氧化应激等过程也受到mTOR通路的调控,所以mTOR通路可能是饥饿调控冷应激耐受机制的重要通路。在这一部分中,我们首先确认了饥饿在斑马鱼中也会抑制mTOR通路的活性。之后又对mTOR通路的活性和斑马鱼的冷应激耐受能力之间的关系进行了确定,雷帕霉素的投喂可以显著抑制斑马鱼mTOR通路的活性,并提高其冷应激耐受;而高亮氨酸饲料会激活斑马鱼的mTOR通路并降低其在冷应激下的存活。为了进一步验证饥饿是否通过抑制mTOR通路来调控相关的冷应激耐受机制,我们全面比较了使用雷帕霉素特异性的抑制mTOR通路和饥饿两种方式对鱼类低温耐受机制的影响。结果发现:mTOR通路抑制（雷帕霉素诱导）和饥饿对斑马鱼mTOR通路的活性、自噬水平、降低机体氧化应激和提高脂肪的供能效率等方面具有相似的影响,但是在对具体功能的影响程度上存在一定的差异,转录组分析的结果也显示两种方式在冷应激下对斑马鱼基因表达模式的影响也非常相似。以上研究结果表明,mTOR通路可能高度参与饥饿对鱼类冷应激耐受机制的调控作用。通过对饥饿改善斑马鱼冷应激耐受的机制进行系统性的阐明,本研究证实了脂肪分解代谢、自噬过程和mTOR通路在鱼类抵抗低温应激中的作用机制,并首次提出一个新的学术观点:鱼类在低温下减少进食可能是其应对低温应激的一种代谢适应策略。