铝毒是酸性土壤或酸化土壤上作物生长的主要限制因素。生产上通常通过增施磷肥和石灰来缓解铝毒的伤害，但这既不经济也不会最终改善土壤的结构。充分利用作物自身潜力或经过分子改良提高作物的抗铝能力是最终解决酸性土壤上铝毒的有效途径。抗铝性被认为是个诱导性过程。因此，克隆铝毒响应基因一方面有助于了解铝毒伤害及抗铝性的分子机理，也便于从中进一步分离抗铝相关基因，是抗逆分子生物学研究中广泛采用的研究策略。水稻既是重要的模式植物，也是一种抗铝性很强的作物，但与大麦和小麦等作物相比，对其抗铝性机理了解甚少。虽已在水稻中克隆到多个铝毒响应基因，但还未能确定哪些是真正的抗铝基因。本研究以水稻抗铝品种湘糯1号为材料，从mRNA和蛋白水平两方面入手，即运用mRNA差异显示和蛋白质组学技术分离克隆铝毒胁迫相关基因或蛋白，旨在为最终阐明植物抗铝性分子机理奠定基础。研究结果总结如下： 1.适用于水稻根mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)的建立 通过对酶源选择、RT-PGR条件和银染条件等方面的修改，建立了适用于水稻根组织中mRNA差异表达的分析技术。该试验方案的重现性好，假阳性率显著降低。 2.铝毒响应基因的克隆 首先用改进的DDRT-PCR结合reverseNorthernblot初步筛选获得了88个铝毒响应基因。从这些候选基因中，对其中的21个进行了Northernblot分析。有10个与初筛结果一致；其余11个中有4个没有检测到mRNA表达水平的差异，7个根本检测不到信号。所确认的10个铝毒响应基因中，7个为铝诱导基因，它们分别是细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(2C22)、金属硫蛋白Ⅱ(2A32和2C20(37))、质体醌-细胞色素C还原酶复合体Ⅳ(2G16)、一个未知蛋白(2C20(36))、铜氨氧化酶(C17)和2C14无蛋白匹配信息；另外3个为铝抑制基因，即百草枯诱导蛋白A(C12)、假定NAD(P)H-醌氧化还原酶2(C55)和钙结合蛋白(G8)。所确认的10个铝毒响应基因中，有6个在植物中尚属首次报道。此外，在78个尚待进一步确认的铝毒响应侯选基因中，有36个是未曾报道过的铝毒响应基因。 3.细胞色素C氧化酶活性及呼吸速率与铝毒胁迫的关系 铝毒处理能显著诱导抗性品种湘糯1号根中细胞色素C氧化酶(COX)活性，而对铝敏感品种湘中籼2号的影响不大，这与前面COX的mRNA表达结果基本一致。 根据上述线索，进一步测定了根的呼吸速率。结果表明：抗性品种湘糯1号和铝敏感品种湘中籼2号在正常生长条件下的细胞色素途径(CP)呼吸差异不大；铝毒处理下，两品种的CP呼吸虽均有下降，但湘糯1号的下降程度明显低于湘中籼2号，由此导致铝毒胁迫条件下抗铝品种的CP呼吸明显高于敏感品种。敏感品种湘中籼2号的交替途径(AP)呼吸在铝毒处理到2天就基本检测不到；尽管抗性品种湘糯1号在铝毒处理过程中AP呼吸也被抑制，但可很快恢复到接近对照水平。上述结果表明铝毒胁迫下，抗铝品种湘糯1号能维持更高的CP和AP呼吸，可能与其适应铝毒相关。应对逆境胁迫常常要以消耗能量为代价，因此保持一定量的CP乎吸是必要的。此外，维持一定的AP呼吸一方面可能缓解铝毒造成的活性氧伤害，另一方面可保证一定的呼吸链电子流，这是柠檬酸循环运转的必要条件。该循环的运转又是有机酸形成分泌的需要，而有机酸的解铝毒作用已被广泛认同。 4.铝毒响应蛋白SAMS的分离鉴定 将对照与铝毒处理的根蛋白进行双向电泳分离，然后挑选出差异蛋白进行质谱鉴定。结果显示：抗性品种湘糯1号在铝毒处理下，SAMS2被诱导，而SAMS1被抑制。然后克隆了这二个同工酶的特异序列作为探针进行Northernblot分析，结果表明：在mRNA表达水平二个基因均有受铝毒诱导提高的趋势，只有SAMS2与其蛋白表达差异相一致，表明SAMS2可能受转录水平所控制；而SAMS1翻译与转录水平结果相反。SAMS是一种利用甲硫氨酸和ATP合成SAM的一个酶。铝诱导了SAMS，可能加速了转巯基化反应和多胺合成。已有研究表明，含巯基物质对缓解金属离子的毒害起重要作用，而多胺不仅能够调节植物的生长和发育，也参与了植物的胁迫反应，因此SAMS可能在适应铝毒中起作用。