研究背景肺部感染是呼吸系统最常见的疾病。病原菌除了直接损伤机体引起疾病外,还可能引起其他疾病的发生,如有研究就认为支气管哮喘的发生发展可能与金黄色葡萄球菌有关。粘附于气道表面粘液层的病原菌大部分通过咳嗽咳痰予以清除。气道及肺泡巨噬细胞是肺部主要的吞噬细胞,他们能清除定植于肺泡和气道表面的少量细菌及外源性灰尘颗粒。当大量的病原菌感染气道时,中性粒细胞及单核细胞转化而来的巨噬细胞便被招募到感染部位以清除病原菌。招募的单核巨噬细胞通过气道粘膜屏障(上皮细胞基底膜和上皮细胞层)而到达气道表面,目前这一过程还缺少动态形态学资料的支持。获取这种细胞活动的动态学资料的最佳方法是在活体动物上直接动态观察细胞的活动。然而,立体动态的细胞活动在活体动物身上获取是非常困难的。因此,模拟组织的体外细胞培养模型就显得尤为重要。但是单一的细胞层及多细胞层的静态研究无法用于巨噬细胞跨膜迁移的研究。因此我们将多细胞层的三维培养技术和激光共聚焦活细胞动态成像结合起来,用来研究气道感染模型中巨噬细胞的跨膜迁移及对金葡菌的清除。研究目的1.建立模拟气道感染的体外多细胞层三维培养模型,在体外模拟肺内部环境,更直观精确的观察细胞和细胞间相互作用以及信号通路的关系。2.将多细胞层三维培养技术和激光共聚焦活细胞动态成像结合起来形成四维成像技术,并用四维成像技术研究气道感染模型中巨噬细胞的跨膜迁移及对金葡菌的清除。研究方法：1.巨噬细胞的分离及纯化；1%淀粉溶液1ml连续腹腔注射小鼠3天,第五天对小鼠进行腹腔灌洗并对灌洗液进行离心洗涤后,并用贴壁法对巨噬细胞进行纯化。2.体外气道感染模型的建立；将LLC细胞种植于插入式培养皿PET膜的上层,五天后待其形成完整细胞层后,将巨噬细胞种植于PET膜的下层,最后将金葡菌种植于LLC细胞层上。3.跨膜电阻的测量；将LLC细胞种植于插入式培养皿PET膜的上层,并分别于第五天、第六天及加入金葡菌后第1、2、3、4、5、6小时用电压电阻仪测量LLC细胞层两侧的电阻。4.巨噬细胞跨膜迁移运动的激光共聚焦显微镜实时成像；气道感染模型建立后并用红色荧光染料标记LLC细胞,将培养体系转移至玻璃底细胞皿,于激光共聚焦显微镜上进行在Z轴(三维)及T轴(时间序列)成像。5.金葡菌或MCP-1对巨噬细胞跨膜迁移的影响评估；建立加金葡菌或MCP-1的实验组气道模型和无金葡菌的对照组气道模型,并在加入金葡菌/MCP-16小时后于激光共聚焦显微镜上三维成像并计算穿膜率。6. ELISA检测MCP-1水平；将LLC细胞种植于插入式培养皿PET膜的上层,第五天实验组加入108级金葡菌于插入式培养皿的上室。3小时后收集实验组和对照组(无金葡菌)的上室及下室的培养基。ELISA检测实培养基中MCP-1的水平。7.逆向跨膜迁移的激光共聚焦显微镜实时成像；将LLC细胞种植于插入式培养皿PET膜的上层,第五天加入巨噬细胞于插入式培养皿的上室,并在插入式培养皿的下室加入小鼠重组MCP-1。将培养体系转移至玻璃底细胞皿于激光共聚焦显微镜上进行在Z轴(三维)及T轴(时间序列)成像。8.巨噬细胞在气道感染模型中吞噬金葡菌的激光共聚焦显微镜实时成像；气道感染模型建立后并用蓝色荧光染料标记LLC细胞及红色荧光染料标记金葡菌,将培养体系转移至玻璃底细胞皿,于激光共聚焦显微镜上进行在Z轴(三维)及T轴(时间序列)成像。9.统计学方法统计使用SPSS13.0软件；数据用均数±标准差表示；巨噬细胞的高度用单侧t’检验,其他用两组间的独立t检验；P<0.05表示差异有显著性。研究结果1.LLC细胞形成完整细胞层；将0.5x106个LLC细胞种植于插入式培养皿PET膜的上层,胞数从24时的1061±97个/mm2逐步增加到120小时的4954±256个/mm2。细胞覆盖的表面积从24小时的27.3±6.0%,逐步增加到120小时的99.8±0.3%。LLC细胞基本能形成完整的单细胞层的时间大约为5天。2.金葡菌对LLC细胞层的完整性无明显影响；我们检测了加入金葡菌前后插入式培养皿PET膜两侧的跨上皮电阻抗的变化。我们发现加入金葡菌后6小时内,无论107级和108级的金葡菌对跨上皮电阻均无明显影响。3.动态观察气道感染模型中巨噬细胞的跨膜迁移；气道感染模型建立后通过激光共聚焦四维成像及IMARIS软件三维重建,其结果显示巨噬细胞通过PET膜上的小孔迁移至培养体系的上室。4.培养体系中加入金葡菌增加了巨噬细胞的跨膜迁移；通过激光共聚焦四维成像及IMARIS7.0三维重建,发现一些巨噬细胞可以通过PET膜上的小孔迁移到插入式培养皿的上层；感染模型组中巨噬细胞的穿膜率显著高于对照组。5.培养体系中加入金葡菌增加了MCP-1趋化因子的表达；我们检测了加入金葡菌的实验组和无金葡菌的对照组中MCP-1的水平差异。在实验组加入金葡菌3小时后,实验组的MCP-1水平明显高于对照组。6.培养体系中加入小鼠重组MCP-1增加了巨噬细胞的跨膜迁移；将重组的小鼠MCP-120ng/ml加入实验组的插入式培养皿的上室。六小时过后,实验组的巨噬细胞穿膜率远远高于对照组。7.培养体系中加入金葡菌影响巨噬细胞在上皮细胞层中的运动方式；通过激光共聚焦四维成像及IMARIS7.0.三维重建和巨噬细胞示踪,我们发现巨噬细胞在插入式培养皿上层主要有三种运动方式。与不加金葡菌的对照组相比,培养体系中加入金葡菌对巨噬细胞的运动方式有影响。另外,在未加入金葡菌的对照组,没有发现巨噬细胞穿过LLC单层细胞层并到达LLC单层细胞层的表面。8.巨噬细胞从上向下跨膜迁移的动态观察；气道感染模型的四维成像显示有巨噬细胞从上层通过PET膜迁移到培养体系的下层。将巨噬细胞种植在LLC单细胞层的表面,并且加入20ng/ml的小鼠重组MCP-1于培养体系的下层,有更多的巨噬细胞从培养体系上层迁移到下层。9.巨噬细胞在气道感染模型中对金葡菌的吞噬具有时间依赖性；气道感染模型的四维成像显示,定植于LLC单细胞层表面的金葡菌粘附于露出于LLC单细胞层的巨噬细胞,随后巨噬细胞被吞噬。随着时间的推移,越来越多的巨噬细胞吞噬了金葡菌,平均每个巨噬细胞也吞噬了越来越多的金葡菌。研究结论：1.依据气道感染时的病理结构,我们成功建立一个可以用于研究巨噬细胞空间活动的体外三维气道感染模型。2.体外三维细胞培养模型与激光共聚焦实时成像结合而成的四维成像技术,可以应用于气道感染模型中巨噬细胞的跨膜迁移及对金葡菌的清除等细胞行为的实时动态成像。