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肝癌是全世界第5大常见肿瘤。肝癌的发病率及死亡率逐年上升。肝癌最常见的病理类型是肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,占肝癌病理类型的90%。肝癌每年造成全世界至少50万人死亡,总的5年生存率仅约15%。肝癌对大部分化疗药物不敏感。仅无临床症状的早期阶段的肝癌有有效的治疗方案,而这部分病人仅占肝癌患者的37%。对早期的肝内高危结节通过活体成像技术进行个体化监测是早期诊断肝癌有效的方式。Glypican-3（GPC3）是磷脂酰肌醇聚糖家族中的一员,通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定于细胞表面。GPC3在HCC中过表达,但在正常成人肝组织中不表达或低表达。GPC3在HCC中表达高于癌前病变。而GPC3在HCC中的mRNA水平高于AFP,这一差异在小肝癌中更突出。GPC3参与了肝癌的发生、发展,目前很多研究认为GPC3是肝癌治疗的潜在靶点。研究者们鉴于GPC3在肝癌中的特异性表达,研究出了GPC3疫苗及抗GPC3抗体。抗GPC3抗体包括鼠源和人源化的单克隆抗体,部分进入临床前期实验。但是目前研究的抗GPC3的抗体大部分为鼠源性或人源性的全长单克隆抗体,分子量大,穿透力、靶向性差,不利于放射性免疫显像或放射性免疫治疗。而通过基因工程改造的抗体片段是放射性免疫显像或治疗发展的方向。其中单链抗体scFv因具有分子量小、免疫源性低、穿透力好等特点,较多应用于放射性免疫显像及治疗的研究。因此本实验针对HCC高表达的GPC3蛋白,利用噬菌体展示技术构建了HCC相关的人源化单链抗体库,并筛选、鉴定了抗GPC3的单链抗体,然后进行放射性标记,对荷人HCC裸鼠进行放射性免疫显像研究。目的:通过噬菌体展示技术制备抗GPC3肝细胞肝癌人源单链抗体,并用放射性核素标记单链抗体,进行放射性免疫显像研究,评价肝癌放射性免疫靶向治疗的可行性。方法与结果:第一部分肝细胞肝癌人源单链抗体scFv的构建1.scFv的制备:从肝癌患者外周血中提取总RNA。然后以此总RNA为模板反转录合成cDNA。此后扩增PCR扩增VH、VL。然后将VH、VL链接上linker,采用SOE-PCR将VH、VL进行连接,构成了VH-linker-VL的单链抗体库。结果:肝癌外周血淋巴结总RNA提取后,用1%琼脂糖凝胶进行电泳,可见两个条带,分别为28S,18S。扩增的VH基因片段大小约为370bp,VL基因片段大小约为350bp。采用SOE-PCR将VH、VL基因片段链接起来,1%琼脂糖凝胶电泳后,显示单链scFv产物大小约为750bp。2.scFv与pCANTAB-5E噬菌体载体双酶切重组:scFv与pCANTAB-5E噬菌体载体采用Sfi I和Not I分别进行双酶切反应。然后将酶切后的产物进行拼接。纯化的拼接产物采用化学法转化感受态大肠杆菌TG1。结果:测得噬菌体的滴度为1011cfu/ml。随机的质粒的鉴定及双酶切鉴定,得到基因的转化效率为87.5%。重组阳性质粒双酶切电泳显示750marker处均出现清晰条带,证明成功重组了scFv。第二部分噬菌体抗体库的筛选1.HCC细胞株对构建的抗体库的筛选:先以正常人肝细胞L02进行对抗体库进行负性筛选,再以肝癌细胞HepG2对抗体库进行3轮富集,测定富集前后抗体滴度。结果显示噬菌体收获率逐渐提高。2.GPC3抗原对抗体库的筛选:将经HepG2细胞筛选的抗体库用GPC3抗原进一步进行3轮筛选富集。结果提示噬菌体收获率逐渐提高。3.可溶性重组抗体的生产:将噬菌体ELISA测定的强阳性重组噬菌体抗体感染E.coli HB2151,经IPTG诱导后获得可溶性抗体。经亲和层析柱纯化后得到纯化的可溶性scFv抗体。4.采用SDS-PAGE和Western blot检测可溶性抗体;ELISA测定抗体特异性及免疫活性。结果:考马斯亮兰染色见30KD左右有明显的条带显示,证实scFv在大肠杆菌HB2151中有可溶性表达。细胞ELISA显示:单因素方差分析显示HepG2细胞组为0.47±0.11,SKOV3细胞组为0.18±0.05,PBS阴性对照组为0.16±0.04,单因素方差分析提示差异有统计学意义（F=103.934,P=0.000）。多重比较（LSD Duncan）统计结果显示,HepG2细胞组与SKOV3细胞组及PBS阴性对照组两两比较差异有统计学意义（p=0.000）。免疫细胞化学显示:抗GPC3的噬菌体抗体能使肝癌HepG2细胞染色,而噬菌体抗体无法使卵巢癌细胞SKOV3染色,在肝癌HepG2细胞阴性对照组中亦无明显染色。说明抗GPC3的噬菌体抗体与肝癌细胞能特异性结合。第三部分131I标记的抗GPC3单链抗体放射性免疫显像1.131I的标记及检测:采用氯胺T法对抗GPC3单链抗体进行131I标记,层析柱纯化后,测定标记率、比活度、放射性化学纯度。并测定131I标记的抗GPC3单链抗体在室温及新鲜人血清中的放射性化学纯度的稳定性。结果:31I标记的抗GPC3单链抗体标记率为80.2±4.0%,放射性化学纯度为92.75±3.2%,放射性活度为3.2±0.2MBq/μg。纸层析法测定的4个时间点,室温及人血清中标记物的放射性化学纯度均>90%,差异无统计学意义（P>0.05）。2.131I标记的抗GPC3单链抗体免疫显像:构建荷肝细胞肝癌裸鼠模型,将131I标记的抗GPC3单链抗体注射入裸鼠体内,分析放射性标记物在裸鼠体内分布情况,并在注射药物后4个时间点进行SPECT显像及图像融合。结果:131I标记的抗GPC3单克隆抗体的放射性瘤/血、瘤/肌肉比值逐渐升高,且在48 h时升为最高。放射性免疫显像图显示,48 h时肿瘤部位的放射性摄取最强,靶和非靶比值最高。结论:本研究利用噬菌体展示技术成果制备了抗GPC3肝细胞肝癌人源单链抗体,成功标记放射性核素后,抗体的标记率高,放射性化学纯度、比活度符合要求,室温稳定性及血清稳定性好。放射性免疫显像显示标记抗体具有特异性及靶向性。