草原龙胆(Eustoma grandiflorum)为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(gentian)观赏植物,原产于美国中南部,因其适应性强、花姿典雅、花茎颀长、花色丰富艳丽而成为国际流行的鲜切花。草原龙胆既具有单瓣花又有重瓣花,重瓣花的四轮花器官发育正常且雄蕊数目稳定,这与重瓣花多存在雄蕊瓣化的现象不同。为了阐释草原龙胆花器官发育的分子机理,探讨花器官特征MADS-box基因的保守性及表达情况,本研究以草原龙胆黄色单瓣(49号)及重瓣花(50号)品系为实验材料,通过RACE技术克隆AG-like亚家族MADS-box基因并开展氨基酸序列分析、系统发生树构建和基因空间表达特异性分析等实验工作,为深入研究草原龙胆花发育的分子机理奠定坚实的基础。(1)以草原龙胆作为实验材料,利用cDNA末端快速扩增技术,根据已知的基因3’端序列设计基因特异引物并克隆基因5’端序列。利用RT-PCR方法克隆获得3条C类MADS-box基因全长cDNA序列,为分析基因进化和表达情况奠定基础。(2)为探究这些基因与已公布的C类基因之间的同源性,将它们的核苷酸及氨基酸序列进行比对以确定其相似性和特殊基序。EgPLE1, EgPLE2和EgPLE3的蛋白质序列和AG及PLE有高度的相似性。多序列比对显示EgPLE1, EgPLE2和EgPLE3都具有MIKC型蛋白质特有的结构域和AG基序,其中AG基序是AG亚家族基因C结构域所特有的。系统进化分析显示这三个基因与核心真双子叶植物的C类MADS-box基因有较近的亲缘关系,说明它们是AG或者PLE的直系同源基因。基因组DNA经限制性内切酶消化后,用EgPLE1, EgPLE2和EgPLE3的特异探针进行杂交实验。结果显示EgPLE1在基因组中至少存在两个拷贝。(3)为检测EgPLE1, EgPLE2和EgPLE3在草原龙胆单重瓣品系中的空间表达特异性,分别以营养和生殖器官的RNA为模板进行RT-PCR。实验结果显示草原龙胆C类MADS-box基因EgPLE1、EgPLE2和EgPLE3均在雄蕊、心皮和胚珠中特异表达但丰度存在一定的差异,EgPLE1和EgPLE2在单瓣花品系雄蕊中的丰度有所减弱。EgPLE1、EgPLE1和EgPLE3在单瓣花品系中的表达丰度均高于它们在重瓣花品系中的表达丰度,其中EgPLE1和EgPLE3的丰度差异较明显。构建EgPLE1和EgPLE3的原核表达载体并将其转入原核表达系统后进行诱导,得到了EgPLE1和EgPLE3蛋白,为蛋白质功能分析和转基因实验奠定基础。