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第一部分显微镜下多血管炎外周血单个核细胞TLR/My D88信号通路基因表达谱的研究【目的】比较显微镜下多血管炎活动期患者和健康对照组外周血单个核细胞中TLR/My D88信号通路相关基因的m RNA表达水平,从而筛选差异表达基因。【方法】采用病例-对照研究,筛选10例活动期显微镜下多血管炎(病例组)和10例健康对照人群(健康对照组)作为研究对象,收集患者的临床资料。分离研究对象的外周血单个核细胞,提取总RNA之后逆转录合成c DNA,采用基因芯片(人TLR通路免疫相关基因芯片)技术检测TLR/My D88信号通路相关基因的m RNA表达水平,使用荧光定量PCR(RT-PCR)方法验证基因芯片结果。【结果】(1)显微镜下多血管炎活动期患者与健康对照组相比,84个TLR/My D88相关基因中有23个基因有差异性表达,其中有13个基因表达量上调,分别是IRAK3(1.5倍,P=0.0205)、TLR4(1.57倍,P=0.0165)、TOLLIP(1.65倍,P=0.0191)、CXCL11(1.67倍,P=0.0461)、FADD(1.83倍,P=0.0239)、TLR6(1.93倍,P=0.0213)、IRF7(1.97倍,P=0.0498)、CD14(2.02倍,P=0.0454)、BCL3(2.02倍,P=0.0312)、TLR1(2.42倍,P=0.0280)、CXCL9(2.51倍,P=0.0498)、MUC1(3.11倍,P=0.0132)、IL10(10.17倍,P=0.0367),其中差异表达较明显的是MUC1(3.11倍,P=0.0132)、IL10(10.17倍,P=0.0367)。有10个基因表达量下调,分别是CXCL10(-1.51倍,P=0.0404)、SARM1(-1.56倍,P=0.0121)、TLR10(-1.57倍,P=0.0499)、ATF3(-1.58倍,P=0.0034)、CIITA(-1.69倍,P=0.0237)、JUN(-1.86倍,P=0.0127)、RIPK2(-1.91倍,P=0.0131)、CHUK(-15.26倍,P<0.0001)、IFNA7(-16.13倍,P<0.0001)、SOCS1(-22.35倍,P<0.0001),其中差异表达较明显的是CHUK(-15.26倍,P<0.0001)、IFNA7(-16.13倍,P<0.0001)、SOCS1(-22.35倍,P<0.0001)。(2)RT-PCR验证结果从23个有差异性表达的基因中随机选取6个基因进行RT-PCR验证,RT-PCR技术检测基因表达倍数变化分别为分别为MUC1(2.78倍,P=0.0392),BCL3(1.99倍,P=0.0138),IRF7(1.88倍,P=0.0116),IL10(2.91倍,P=0.0125),TLR10(-1.86倍,P=0.0203),JUN(-1.81倍,P=0.0408),验证结果显示基因芯片检测的差异表达与RT-PCR检测的差异表达趋势一致。【结论】本研究发现显微镜下多血管炎活动期外周血单个核细胞中多个TLR/My D88信号通路相关基因表达水平发生了变化,这些异常表达的相关因子涉及Toll样受体、TLR负调控分子、接头蛋白基因、与TLR相互作用的蛋白基因、TLR效应因子基因、TLR信号通路下游基因、转录靶基因及炎症细胞因子,表明TLR/My D88信号通路可能是导致显微镜下多血管炎发病的一条重要免疫调节信号通路。第二部分显微镜下多血管炎外周血中性粒细胞TLR/MyD88信号通路基因表达谱的研究【目的】比较显微镜下多血管炎活动期患者和健康对照组外周血中性粒细胞中TLR/My D88信号通路相关基因的m RNA表达水平,从而筛选差异表达基因。【方法】采用病例-对照研究,筛选20例活动期显微镜下多血管炎(病例组)和12例健康对照人群(健康对照组)作为研究对象,收集患者的临床资料。分离研究对象的外周血中性粒细胞,提取总RNA之后逆转录合成c DNA,采用基因芯片(人TLR通路免疫相关基因芯片)技术检测TLR/My D88信号通路相关基因的m RNA表达水平,使用荧光定量PCR(RT-PCR)方法验证芯片结果。【结果】(1)显微镜下多血管炎活动期患者与健康对照相比,84个TLR相关基因中有18个基因有差异性表达,其中有13个基因表达量上调,分别是TRAF3(1.52倍,P=0.0237)、NFΚB1(1.65倍,P=0.0086)、LY96(1.85倍,P=0.0002)、IRF7(1.93倍,P=0.0188)、IRAK4(1.93倍,P=0.0224)、TLR6(2.00倍,P=0.0092)、CASP1(2.01倍,P=0.0032)、TBK1(2.06倍,P=0.0145)、IRAK3(2.50倍,P=0.0066)、TLR10(2.55倍,P=0.0048)、IL10(2.70倍,P=0.008)、JUN(2.90倍,P=0.0006)、MAPK14(3.06倍,P=0.0015),其中差异表达最明显的是MAPK14(3.06倍,P=0.0015)。有5个基因表达量下调,分别是TNRC5(-1.53倍,P=0.0003)、TLR7(-1.85倍,P=0.0284)、SIGIRR(-2.10倍,P=0.0227)、CIITA(-2.26倍,P=0.0205)、MAP3K7IP1(-2.28倍,P<0.0001),其中差异表达最明显的是MAP3K7IP1(-2.28倍,P<0.0001)。(2)RT-PCR验证结果从18个有差异性表达的基因中随机选取4个基因进行RT-PCR验证,RT-PCR技术检测基因表达倍数变化分别为IL10(1.80倍,P=0.0478),TLR10(2.50倍,P=0.0224),NF-ΚB1(5.27倍,P=0.0057),TLR7(-10.65倍,P=0.0027),验证结果显示基因芯片检测的差异表达与RT-PCR检测的差异表达趋势一致。【结论】本研究发现显微镜下多血管炎活动期患者外周血中性粒细胞中多个TLR/My D88信号通路相关基因表达水平发生了改变,这些异常表达的相关因子涉及Toll样受体、TLR负调控分子、凋亡相关基因、与TLR相互作用的蛋白基因、TLR信号通路下游基因、转录靶基因及TLR辅助分子,表明TLR/My D88信号通路可能是导致显微镜下多血管炎发病的一条重要免疫调节信号通路。