霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的急性肠道传染病,始于1961年、至今未停息的第七次霍乱大流行由霍乱弧菌的O1群El Tor型引起。目前我国使用噬菌体-生物分型相结合的方法对El Tor型菌株进行分型,VP3是使用的五个分型噬菌体之一。了解分型噬菌体感染霍乱弧菌的机制、噬菌体敏感菌株和抗性菌株之间的差异对于了解El Tor型霍乱弧菌的遗传差异和分化、以及在我国已沿用多年的噬菌体-生物分型的机理有重要作用。我们前期研究中已对VP3进行了全基因组测序,并进行了初步的生物信息学分析。VP3属T7家族,预测存在52个编码基因和17个保守的启动子序列,发现El Tor型全基因组测序株N16961的VP3敏感性与脂多糖核心寡糖OS的合成基因簇(wav基因簇)有关。这里我们进一步研究VP3敏感性和上述基因的相关性。我们对N16961wav基因簇中的基因VC0231进行缺失,缺失突变株表现为VP3抗性。对缺失突变株和以前本室构建的VP3抗性的N16961转座子插入突变株进行相应基因的回补实验,回补菌株恢复对VP3的敏感性。我们克隆表达了预测的VP3尾丝蛋白gp44,FITC标记后以激光共聚焦显微镜观察重组蛋白与N16961野生株、突变株和回补株的结合能力,发现gp44与菌株能否结合与各菌株对VP3的敏感性一致,说明wav基因簇产物OS为VP3结合位点,同时证明gp44作为VP3的尾丝蛋白具有受体识别功能。我们还发现,部分野生型的VP3抗性菌株也可以结合FITC标记的gp44,这些抗性菌株的wav基因簇序列与敏感菌株相同或高度相似,提示存在其他VP3抗性机制。我们对VP3基因的转录时序进行了检测和分析。在VP3感染N16961后的不同时间点提取裂解混合物的总RNA,检测VP3每个启动子下游的1个以上基因的转录。发现VP3基因组从左到右进行转录,按照转录被检测到的时间可以将VP3基因分为早中晚三期。分析VP3基因组,我们预测出6个rho-非依赖性终止子,其中终止子T1和T6推测有一定的终止效率。转录时序检测结果与基因功能、基因在基因组中的位置和转录终止子的预测结果相对应。通过本研究,我们证明霍乱弧菌分型噬菌体VP3在敏感菌表面的受体是核心寡糖,部分对VP3感染有抗性的野生型菌株存在核心寡糖受体之外的复杂的抗感染机制。VP3以尾丝蛋白gp44与受体结合。VP3基因按照转录时序可分为早中晚三期。霍乱弧菌分型噬菌体的感染受体和转录时序研究为我国的噬菌体-生物分型机理提供重要的理论基础,让我们初步了解VP3的感染过程,也为我们提出新的研究内容和方向。对病原细菌的分子分型可用于分析菌株差异,在流行病学上用于传染病调查以及发现新病原。脉冲场凝胶电泳分型(Pulse-Field GelElectrophoresis,PFGE)是其中的一个重要方法。在传染病实验室监测中需要进行PFGE方法的统一,使不同实验室获得的结果可相互比较。PFGE技术应用于细菌分型时,选择方案的原则是产生足够数量的限制性片段,通过电泳能在琼脂糖凝胶上最大程度体现图谱差异,从而体现基因组差异。限制性片段数量和大小由使用的限制性内切酶决定,而条带在一定浓度电泳胶上的分布由电泳参数决定。在内切酶确定的情况下,确定对不同菌株有最大区分能力的电泳参数,是进行分型方法标准化中需要着重考虑的问题。电泳参数的区分能力可通过指纹图之间的相似系数衡量,相似系数越小,指纹图差异越大,电泳参数对菌株区分能力越强。所以在给定限制性内切酶的情况下,比较不同电泳参数,选择能产生较小相似系数的参数,可增强对不同菌株的区分能力。霍乱是一种急性的经食物和水传播的传染病,多种分子分型方法被用于研究霍乱弧菌菌株间的遗传相关性,从而进行暴发调查和监测,其中PFGE表现出较高区分能力和与流行病学资料的一致性。NotⅠ是适用于霍乱弧菌PFGE分析的首选限制性内切酶。本研究中,我们以NotⅠ限制性酶切霍乱弧菌染色体,然后以不同电泳参数分析;对于两株菌之间的相似性,每种电泳参数将给出一个相似系数的值;将反映两株菌相似性的这四个数值作为一个区组,四种电泳参数即四种处理方法,通过适用于随机区组设计的统计学方法比较四种参数的效果,选出一种能给出最小相似系数的电泳参数,我们认为此参数对测试株有最大区分能力,是四种参数中最优者。本研究建立了一种在细菌PFGE中筛选、优化电泳参数的分析过程,这个分析方法也为其它细菌的分子分型标准化中确定最优的分型方法提供参考。