基于环糊精的黄曲霉毒素B1荧光增敏检测技术研究

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黄曲霉毒素B1(AFB1)目前发现的已知毒性最强的天然化学致癌物质之一,广泛存在于花生、玉米等农产品及食品中,严重威胁着人畜健康和生命安全,对AFB1检测是当前农产品质量安全和食品安全的研究热点和难点。针对目前AFB1前处理过程中基质干扰严重,检测灵敏度低等问题,本文采用了免疫亲和柱结合荧光增强检测的方法,建立了高灵敏度的AFB1检测技术,对保障农产品质量与食品安全,打破农产品国际贸易技术壁垒等均具有重要的理论意义和应用价值。主要研究结果如下:1.通过对β-环糊精及其衍生物2,6-二甲基-β-环糊精对黄曲霉毒素B1荧光增强作用的研究,确定了反应的激发波长为365nm,发射波长为440nm,实验结果表明,在2 mL 10.0μg/kg黄曲霉毒素B1溶液中加入1 mL 0.01 mol/Lβ-环糊精或其衍生物时AFB1荧光增强倍数最大,其中β-环糊精可使荧光信号增强5倍,2,6-二甲基-β-环糊精荧光增强倍数为8倍,表明2,6-二甲基-β-环糊精对黄曲霉毒素B1荧光增强作用显著;实验探索了环糊精和黄曲霉毒素B1之间的主客体包合作用,其主客体包合比为1:1,包合常数为12.237;黄曲霉毒素B1荧光增强前后的线性关系良好,相关系数R2均达到0.99以上;在室温下利用该荧光增强剂,干扰金属离子Mg2+、Ca2+、K+、Na+、Cl-、(H2PO4)-(浓度低于10-2 mol/L)等以及花生基质对环糊精的荧光增强作用没有影响。2.利用高灵敏度AFB1单克隆抗体和氨基硅胶微球进行偶联,制备AFB1免疫亲和柱,研究了免疫亲和柱(IAC)的制备和特征特性。近红外光谱结果显示两者的偶联效果良好,氨基硅胶微球和粗提AFB1单克隆抗体蛋白偶联,0.2 mL偶联物的装柱容量范围为30 ng到107 ng AFBB1可调,平均蛋白偶联率为87%;选择样液20%甲醇浓度为上样浓度、磷酸盐缓冲液作淋洗液、甲醇作洗脱剂为最佳的富集净化条件;与商品化的黄曲霉毒素免疫亲和柱和多功能净化柱进行实际花生样品高效液相色谱法比对分析,三者的检测结果无显著差异。两种免疫亲和柱特征特性比较显示自制免疫亲和柱AFB1的最低截获量低至0.01μg/kg,并且柱容量高达107 ng,净化时间缩短为10 min,成本低,操作简单且具有良好的稳定性,适合应用于大批量样品快速筛查。3.建立了基于新型荧光增强剂的AFB1免疫亲和荧光光度快速检测技术,并优化了花生中黄曲霉毒素B1的提取净化条件。结果表明,样品磨碎粒径过20目筛,提取液80%甲醇水溶液,采用超声波辅助提取的方法使提取回收率为90%,建立了一套快速、准确、简易的IAC前处理技术;将β-环糊精荧光增强效应引入黄曲霉毒素(AFT)免疫亲和快速测定技术中,应用于农产品及食品中AFT检测,提高了检测的灵敏度,最低检测限为0.3μg/kg,回收率为90%-115%;与基于国家标准方法的高效液相色谱法、ELISA法以及胶体金试纸条法进行花生、饲料、玉米、花生油样品的比对检测,几种检测方法检测结果一致,本项研究方法具有操作简单,速度快,准确度高等特点,同时提高了对环境及检验人员的安全性,为黄曲霉毒素高灵敏快速检测技术开辟了新的途径。
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