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第一部分有效转染DRG细胞TRPV4SiRNA的浓度筛选目的:建立大鼠背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)细胞基因转染细胞模型,观察在SiRNA转染下培养24h和48h的神经元形态和活性的变化,筛选这种神经元siRNA转染的浓度。方法:取新生Wistar大鼠腰背段全部DRG,将处理好的DRG神经元进行培养,根据时间,将神经元随机分为正常对照组、SiRNA不同浓度组、在SiRNA中培养相应时间后观察各组神经元在荧光显微镜的形态学特点,并用MTT法分析各组神经元细胞生长活性的改变。另外采用结果:荧光显微镜下观察SiRNA转染培养组DRG神经元形态较正常组五无明显差异。MTT法比较10-40nM各组神经元活性的差异无统计学意义。利用FLUO3荧光探针,观察SiRNAa作用下细胞内游离钙对低渗溶液的反应,采用ELISA方法观察KCL刺激下各组细胞释放P物质的改变,结论:40-80nMSiRNA可以有效转染DRG细胞,并对细胞内游离钙对低渗溶液的反应产生影响,并且对释放P物质也有抑制作用,同时未对DRG神经元活性产生显著影响,此方法有望成为一种在分子水平研究TRPV4通道对DRG神经元的影响的有效细胞模型。第二部分RNA干扰抑制大鼠背根神经节细胞的TRPV4表达目的TRPV4(transient receptor potential vanilloid 4)是大鼠背根神经节伤害性传导的重要感受器,本实验拟应用体外转录合成的SiRNA转染原代培养背根神经节神经元,诱导非选择性钙离子通道TRPV4基因表达沉默,观察对TRPV4表达以及功能的影响,探讨以TRPV4为靶点、采用RNA干扰的方法进行疼痛研究的应用前景,为TRPV4的功能研究提供新的方法。方法根据RNA干扰的原理及SiRNA的设计原则,设计2对长度为19bp的TRPV4基因SiRNA(SiRNAa和SiRNAb),另选择相同长度的无义双链RNA作为阴性对照RNA体外转录合成SiRNA,将SiRNA转染体外培养背根神经节神经元,采用荧光定量RT-PCR,Western blot检测TRPV4mRNA以及蛋白的表达。结果SiRNA可以有效转染DRG细胞,并在低渗条件下引起细胞TRPV4表达的明显降低。SiRNAa和SiRNAb可以分别使得TRPV4mRNA降低,在低渗状态下,对照组与错配组mRNA的表达均明显增高,分别为正常细胞外液的3.88以及3.75倍。而SiRNAa组则为1.26倍,SiRNAb组为1.87倍,明显抑制了TRPV4的mRNA表达(P=0.0187,P＜0.05)。对照组与错配组蛋白表达的表达均明显增高,分别为正常细胞外液的3.26倍以及3.56倍。而SiRNAa为1.01倍,SiRNAb为1.28倍,也表现出明显的抑制作用(P=0.0028,P＜0.05)。以上实验筛选出A序列更为有效。结论TRPV4是一个在低渗状态信号转导的重要组成部分。本实验所设计的SiRNA可以在DRG神经元内有效抑制TRPV4mRNA和蛋白的表达水平,并且可以有效抑制TRPV4的功能。因此,SiRNA有可能成为TRPV4相关的病理状态,尤其是疼痛的潜在治疗方式。本实验筛选出的序列SiRNAa将为以后的实验提供实验依据。第三部分:大鼠背根神经节上TRPV4通道蛋白功能的抑制背景TRPV4在炎性痛和神经痛感觉传导中有重要的作用,我们既往的研究也表明,TRPV4在背根神经节慢性受压的病理改变中也起到一定的作用。尽管我们在以上的实验中观察到TRPV4SiRNA可以有效抑制mRNA和蛋白的表达,但是我们对TRPV4SiRNA是否能抑制其功能并不明确。本实验拟应用体外转录合成的SiRNA转染原代培养背根神经节神经元,观察TRPV4的功能改变。方法SiRNAa另选择相同长度的无义双链RNA作为阴性对照RNA体外转录合成SiRNA,将SiRNA转染体外培养背根神经节神经元,采用共聚焦显微镜的方法,利用FLUO3荧光探针,观察SiRNAa作用下细胞内游离钙对低渗溶液的反应,采用ELISA方法观察KCL刺激下各组细胞释放P物质的改变,同时本实验采用细胞免疫化学的方法观察了TRPV4与PKC表达的相关性。结果DRG细胞中钙浓度变化,30%低渗溶液引起的DRG细胞中钙浓度峰值在对照组以及错配组中均有明显的升高,(p＜0.01).而与以上两组对照,SiRNAa组DRG对低渗溶液的反应明显降低,p＜0.01。P物质释放的检测结果表明,Kcl刺激前后,对照组以及错配组有明显的P物质释放增多,SiRNAa以及SiRNAb组则出现明显的抑制作用(P=0.023,P＜0.05)。免疫细胞化学的结果表明SiRNA组细胞荧光明显降低减弱.光密度值检测有统计学意义.(p＜0.05).结论TRPV4是一个在低渗状态信号转导的重要组成部分。本实验所设计的SiRNA可以有效抑制TRPV4的功能。因此,SiRNA有可能成为TRPV4相关的病理状态,尤其是疼痛的潜在治疗方式。本实验筛选出的序列SiRNAa将为以后的实验提供实验依据。序列;为以后的研究奠定基础。另一方面,明确RNAi是否可以在DRG细胞中有效抑制TRPV4基因和蛋白的表达,同时抑制TRPV4的功能活性。