论文部分内容阅读
斜纹夜蛾是一种重要的食叶昆虫,对很多农作物极其具有破坏性。在本研究中从斜纹夜蛾幼虫中克隆到Rel/NF-kB的家庭成员Dorsal和Relish可变剪切体(Dorsal 14,Dorsal]B,Relish 1A和Relish 1B)。Dorsal和Relish全长序列和他们的2个剪切体从同一个斜纹夜蛾幼虫中克隆得到的。对保守结构域分析得到Dorsal和Relish有两个共同的结构域,第一个是Rel同源结构域(RHD),即真核细胞特征Rel/NF-kB转录影响因子,第二个是免疫球蛋白-丛蛋白-转录(IPT)结构域,其是类免疫球蛋白折叠域主要负责DNA结合。Dorsal 1B具有RHD、IPT、NLS和LZ结构域,而Dorsal1A具有和Dorsal1B相同的结构域,并且Dorsal 14比Dorsal 1多一个叉头N末端区域。Relish 1A具有RHD,IPT,ANK和死亡结构域,而Relish7B有着和Relish 1A 一样的结构域。Dorsal的氨基酸序列与无脊椎动物和脊椎动物的数据库中19个Dorsal和3个Relish蛋白序列对比,进化树显示出Dorsal与棉铃虫(HaDorsal)和烟草天蛾(MsDorsal)同源基因聚集在一起。推导的Relish氨基酸序列与无脊椎动物和脊椎动物的数据库中19个Relish和3个Dorsal蛋白序列对比。进化树显示Relish与棉铃虫(HaRelish)和甜菜夜蛾(SeRelish)同源基因聚集在一起。Dorsal和Relish所有的氨基酸蛋白序列都包含Rel/NF-kB家族转录因子所具有的特异保守结构域,故克隆的Dorsal和Relish基因均属于Rel/NF-kB家族。通过获得Dorsal和Relish在不同组织和发育阶段mRNA表达量,从而分析出基因组织表达和龄期表达的规律。Dorsal的两个剪切体在斜纹夜蛾不同的组织和发育阶段均有表达,并且在不同阶段转录水平具有显著差异。Dorsal 1A在卵和雌蛹阶段有更高的表达水平。Dorsal 1A在雌蛹和雌成虫阶段转录水平显著高于雄蛹和雄成虫阶段,但是Dorsal 1B在蛹和成虫阶段雌雄成虫转录水平无显著性差异。Dorsal 1A和Dorsal 1在不同组织中的转录水平有显著性差异,Dorsal 1A在脂肪体和体壁具有较高的表达水平,而在中肠的表达水平最低。Dorsal 1B在体壁和脂肪体中的表达量较高。同样的,Relish的两个剪切体在斜纹夜蛾不同的组织和发育阶段都有表达。他们在不同的发育阶段的转录具有显著差异。在蛹和成虫阶段雌蛹和雌成虫个体Relish 1A转录水平比雄性显著高。但是Relish 1B在蛹和成虫阶段雌雄个体并没有表现出显著差异。Relish在不同组织中的转录水平具有显著差异。空间的表达谱表明,Dorsal在体壁中表达水平最高,而Relish在脂肪体的转录水平最高。RelishlA在脂肪体和血淋巴中具有较高表达量在中肠中表达量最低。Relish1B在脂肪体中的表达量最高,在中肠中的表达量最低。并且在脂肪体中表达水平均比其他阶段高。Dorsal和Relish的两种剪切体均在脂肪体内具有高水平转录,这表明脂肪体在先天免疫中发挥了重要的作用。分别注射大肠杆菌、爪哇棒束孢和球孢白僵菌,分析斜纹夜蛾幼虫Dorsal和Relish在微生物侵染后表达规律的特性和差异。Dorsal在被真菌侵染后表达量上调,而细菌侵染后表达量并不上调。Relish在被大肠杆菌(革兰氏阴性菌)侵染后表达量上调,但是真菌侵染后表达量并无明显变化。进一步证明了在Toll通路下游的Dorsal与真菌之间的相关性,在IMD通路下游的Relish与革兰氏阴性菌的相关性。Dorsal被球孢白僵菌上调的表达持续时间比爪哇棒束孢长。Relish7B对大肠杆菌注入后反应速度比Relish 1A慢。这四个基因应对不同的微生注射后表现出不同的表达特性。斜纹夜蛾幼虫同时注射先天免疫基因(Dorsal/Relis)的dsRNA和微生物悬浮液,幼虫的死亡率明显升高。dsRNA注射后下调了Dorsal/Relish的表达量,降低了幼虫对于微生物侵染的抵抗作用,从而增加微生物侵染的成功率。研究了 Dorsal和Relish在所测斜纹夜蛾幼虫的不同组织和不同发育阶段表达特性。通过注射微生物悬浮液观察不同微生物对于Dorsal和Relish诱导表达特点。同时注射微生物悬浮液和Dorsal和Relish基因的dsRNA,发现微生物对斜纹夜蛾幼虫致病性明显提高。并且构建了可以在丝状真菌中表达Dorsal dsRNA的载体P-F-R。目前的数据表明,Dorsal和Relish是斜纹夜蛾先天免疫重要组成部分。通过对斜纹夜蛾如何通过先天免疫应对各种病原体侵染的研究,可以为生物防治该类害虫提高理论基础的研究。