研究背景恶性肿瘤发病率和死亡率居高不下,严重危害人类健康,传统治疗方法对中晚期患者疗效非常有限,临床上亟待研究更为有效的治疗方法。生物治疗中的免疫细胞治疗和基因治疗近年来发展迅速,接连在技术和疗效上取得突破,受到广泛关注。免疫细胞治疗中的过继免疫疗法(adoptive cell therapy)已在临床广泛应用并取得一定的治疗效果。然而由于肝癌瘤内肿瘤微环境相对复杂,细胞浸润不足,且浸润的免疫细胞无法发挥肿瘤杀伤作用,而且在这些免疫抑制信号的作用下效应细胞大量死亡或衰竭。因此如何突破肿瘤微环境的限制,提高免疫治疗的效果是目前研究的热点和难点。溶瘤病毒介导的基因治疗(“病毒-基因”治疗)是基因治疗中的一个新策略,利用溶瘤病毒在肿瘤组织中不断复制和再感染作用,可最大程度地感染肿瘤细胞,并长期维持基因的表达。同时研究发现溶瘤病毒在感染和裂解肿瘤细胞后能产生“危险”信号、释放Ⅰ型干扰素并暴露肿瘤抗原。肿瘤内的抗原递呈细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)识别危险信号,并递呈肿瘤抗原,可引发宿主产生针对肿瘤的免疫反应。利用溶瘤病毒载体大量表达免疫活化因子或抑制性受体的阻断剂,可进一步解除肿瘤免疫抑制,增强抗肿瘤的免疫反应作用。IL-12是一种重要的免疫活化因子,其可直接作用于T淋巴细胞和NK细胞,在天然免疫反应和过继免疫反应中扮演重要的角色。IL-12除了直接作用于免疫系统促进免疫活化外,还能够诱导血管内皮细胞上调表达内皮粘附分子对引导T淋巴细胞浸润至肿瘤组织具有促进作用。基于以上原因,本课题的第一部分希望探讨将“细胞过继免疫疗法”与“病毒-基因”疗法进行联合的可行性。一方面通过“病毒-基因”疗法向肿瘤病灶直接注射表达免疫活化基因IL-12的溶瘤腺病毒,利用病毒的溶瘤作用和肿瘤局部表达高浓度的IL-12因子,打破肿瘤免疫抑制微环境,产生急性炎症环境。另一方面通过外源输注过继免疫细胞CIK,使外源的免疫细胞在急性炎症环境下更好的发挥抗肿瘤作用。实现“细胞-病毒-基因”强强联合的治疗效果。虽然“病毒-基因”疗法具有诸多优点,显示出广泛的治疗前景,然而受到药物输注方式的制约,限制其适应症范围。1)肿瘤局部注射,即将药物直接注射到肿瘤组织。这种给药方法病毒能最大限度地到达肿瘤组织。但这种方式对部分患者损伤较大,需要手术配合,具有风险,且恶性肿瘤多呈弥散性生长或广泛转移,难以实现原位直接注射。2)脉管系统输注,该方法操作相对简单,药物能够通过血液系统运输至各个组织器官,解决弥散性转移难题。然而病毒类药物直接暴露于血液系统中,病毒将被血管内皮细胞和血细胞大量非特异吸附,或被抗体中和失去感染能力。加之血液系统运输病毒无肿瘤特异性,大量病毒被运输至非肿瘤组织而难以发挥作用,最终能够到达肿瘤位点的病毒非常有限。利用细胞作为运载工具靶向运输基因治疗载体的优势在于:1)基因治疗载体装载于载体细胞中,可以减少直接与体液环境相接触,避免抗体中和作用。2)选择对肿瘤病灶具有趋向性的细胞载体,可以帮助所装载的病毒集中到达肿瘤病灶,减少因病毒感染健康组织而产生的病毒损失和毒副作用。3)用于病毒类基因治疗载体运输的细胞,同时可以作为病毒增殖的宿主,通过在载体细胞中的增殖作用,病毒释放于肿瘤病灶的滴度得以大幅提高。Ad5/11嵌合型病毒是在目前基因治疗常用的5型腺病毒的基础上,将自身5型病毒Fiber结构中的Konb和shaft区域替换成Ad11型病毒的Fiber结构,使得嵌合型病毒获得11型腺病毒的感染特性,可以通过识别广泛表达的补体调节分子CD46感染细胞,既可感染上皮和间质来源的肿瘤细胞,又可感染淋巴来源的免疫细胞,是用于免疫细胞运载的理想载体。基于以上原因,本课题的第二部分希望探讨利用CIK细胞作为病毒载体的运载工具,通过CIK细胞的肿瘤归巢特性,将病毒携带至肿瘤位点,解决弥撒生长或广泛转移的肿瘤患者的给药难题。第一部分:研究表达IL-12的双靶向溶瘤腺病毒联合CIK细胞对肝癌的治疗效果试验目的探讨CIK细胞联合表达IL-12的溶瘤腺病毒的体内外抗肿瘤作用,分析其联合抗肿瘤作用的机制,为“细胞-病毒-基因”联合疗法提供实验基础。实验内容及方法1.利用细菌重组技术,在课题组双靶向性溶瘤病毒Ad CN205系统的基础上构建表达IL-12基因的肿瘤特异性溶瘤病毒Ad CN205-IL12;2.通过检测溶瘤病毒Ad CN205-IL12在BEL7404、Hu H-7、SMMC7721等肿瘤细胞系和正常肝细胞AKN-1中的病毒复制能力,IL-12基因表达水平,来验证其肿瘤特异性;3.通过对比溶瘤病毒Ad CN205-IL12对肿瘤细胞BEL7404、Hu H-7、Hep3B和正常肝细胞AKN-1的体外杀伤作用,来验证其肿瘤靶向杀伤能力;4.采集健康志愿者外周血,通过淋巴细胞分离液分离得到PBMC细胞,在IFN-γ,OKT3,IL-2,IL-1等因子的共同刺激下培养获得CIK细胞,通过流式细胞技术分析培养14天的细胞表面CD3、CD4、CD8、CD56、NKG2D等的表达,鉴定细胞CIK细胞培养效果;5.通过表达荧光素酶的慢病毒载体p CDH-EF1α-Luciferase-2A-m Cherry构建稳定表达Luciferase的靶细胞系,检测CIK与溶瘤病毒联合杀伤后靶细胞系Hu H-7和Hep3B中残余Luciferase的酶活性,替代Cr51同位素释放试验来研究CIK细胞联合溶瘤病毒的体外杀伤效果;6.建立Hu H-7细胞系的SCID小鼠体外移植瘤模型,通过肿瘤局部注射溶瘤病毒(2×108PFU)联合尾静脉注射CIK细胞(1×107),测量肿瘤生长体积绘制肿瘤生长曲线和观察小鼠存活情况绘制小鼠生存曲线来研究联合治疗效果,通过多因素方差分析和log-rank对数秩检验来评价联合治疗的优势;7.通过免疫荧光观察肝脏组织和肿瘤组织种GFP表达情况,Elisa检测IL-12表达情况,以及通过免疫组化标记病毒Hexon蛋白来研究外源基因表达及病毒复制的特异性;8.通过免疫组化标记人CD3分子研究CIK细胞浸润肿瘤组织的情况,通过免疫组化标记CD34分子研究肿瘤血管密度,研究CIK联合表达IL-12的溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用机制。实验结果1.成功构建表达人IL-12的双靶向溶瘤腺病毒载体Ad CN205-IL12,该病毒用人端粒酶启动子代替病毒原有启动子来调节病毒复制;同时病毒E1A基因的CR2区删除与RB蛋白相互作用的24bp序列使得病毒在正常细胞中复制受到限制;外源基因插入至E3区6.7k/gp19k位点,且受到病毒E3区内源性启动子的调控。2.该病毒在SMMC7721,BEL7404,MHCC97H,Hu H-7及Hep3B等肝癌细胞中的复制能力与各细胞系端粒酶表达水平相关,说明病毒的复制受到端粒酶启动子的调节,而在正常肝来源的细胞系中不能复制,说明病毒的复制具有肿瘤特异性。3.通过观察Ad CN205-GFP病毒感染肝癌细胞系BEL7404和正常肝来源的细胞系AKN-1发现GFP基因在肿瘤细胞中表达量显著高于正常肝来源的细胞;通过ELSIA检测Ad CN205-IL12病毒感染肝癌细胞系BEL7404和正常肝来源的细胞系AKN-1后IL-12 P70的表达情况,结果显示肿瘤细胞系中IL-12基因的表达水平显著高于正常肝来源的细胞系,表明外源基因表达具有肿瘤特异性;4.通过对体外培养14天的CIK细胞进行检测,结果显示CD3阳性的T细胞占总细胞群体的94.05%±6.74%,CD3/CD4双阳性的Th细胞占总细胞群体的12.13±1.58%,CD3/CD8阳性的CTL细胞占总细胞群体的69.2%±4.75%,CD3/CD56双阳性的NKT细胞占总细胞群体的25.48±4.77%,CD3-/CD56+的NK细胞占总细胞的5.33%±4.32%,共有83.5±3.87%的细胞表达与肿瘤非特异杀伤相关的NKG2D分子。此结果与以往的报道的CIK细胞表型一致。5.Ad CN205-IL12和Ad CN205-GFP对肿瘤细胞具有较强的杀伤能力,但两者之间无差异。说明IL-12基因不能提高溶瘤病毒的体外杀伤作用能力。表达IL-12的非复制型病毒Ad IL-12体外对肿瘤细胞也无杀伤作用。说明单纯的IL-12对肿瘤细胞无直接杀伤效果。6.在效靶20:1的情况下,IL-12提升CIK细胞的体外抗肿瘤作用,由14.37%±2.24%提升至34.68%±1.78%,P=0.000553,在40:1的情况下抗肿瘤作用由51.50%±1.19%提升至70.23%±0.96%,p=0.001979,提示IL-12可以显著提升CIK细胞对肝癌细胞的抑制作用;7.在效靶比10:1,病毒感染系数为10MOI的情况下,对于肝癌细胞系Hu H-7,在48h的时间点,CIK细胞联合Ad CN205-GFP组较单CIK组,肿瘤细胞存活率降低,差异显著(n=3,p=0.0260),CIK细胞联合Ad CN205-IL12组较单CIK组肿瘤细胞存活率降低,差异极显著(n=3,p=0.0018);72h的时间点CIK联合Ad CN205-IL12组较联合Ad CN205-GFP组的肿瘤抑制作用更强,差异显著(n=3,p=0.0135);8.在效靶比10:1,病毒感染系数为10MOI的情况下,对于肝癌细胞系Hep3B,CIK细胞联合Ad CN205-IL12组较单CIK组肿瘤细胞存活率降低,差异极显著(p=0.0001),较单独Ad CN205-GFP组肿瘤细胞存活率降低,差异极显著(p=0.00026),较单独Ad CN205-IL12组肿瘤细胞存活率降低,差异极显著(p=0.00032),较CIK联合Ad CN205-GFP组肿瘤细胞存活率降低,差异极显著(p=0.00027)。在72h的时间点,CIK细胞联合Ad CN205-IL12病毒组较其他各组均有极显著的抑制效果(P<0.001)。提示CIK细胞联合溶瘤病毒可提升对肿瘤细胞的抑制作用,表达IL-12基因可进一步提升抗肿瘤效果。9.体内移植瘤模型治疗结果显示,单一治疗组(Ad CN205-GFP,Ad CN205-IL12,CIK)相对PBS组而言具有一定的肿瘤抑制效果,且差异极显著(n=8,p<0.001),但是单一治疗组之间并无显著差异。CIK细胞联合Ad CN205-GFP组较单一治疗组Ad CN205-GFP(n=8,p=0.02)和CIK(n=8,p=0.008)具有显著差异。CIK细胞联合Ad CN205-IL12组具有最强的抗肿瘤作用,其较所有单一治疗组具有极显著差异(n=8,p<0.001),较CIK联合Ad CN205-GFP组抗肿瘤效果更显著(n=8,p=0.047)。治疗过程中发现,CIK细胞联合Ad CN205-IL12组中有2只小鼠肿瘤完全消失。10.在小鼠生存时间上,PBS组与其它各治疗组间均有统计学差异。但各治疗组间差异不显著。11.体内移植瘤模型治疗结果显示,CIK联合Ad CN205-IL12组,CIK联合Ad CN205-GFP组,及单Ad CN205-GFP组的瘤组织出现大量坏死,而PBS组,CIK组及Ad CN205-IL2组坏死区域相对较少;CIK联合Ad CN205-IL12组浸润的人源CD3阳性的细胞数显著高于其他组。说明IL-12可增强CIK细胞的浸润或促进CIK细胞在肿瘤细胞内的增殖或存活;12.GFP或IL-12仅在肿瘤组织有表达,而在肝脏组织中未检测到GFP或IL-12的表达,提升CIK联合溶瘤病毒治疗不影响外源基因在组织中表达的特异性。免疫组化的结果显示病毒仅在肿瘤细胞中能够检测出来,而在正常肝脏中检测不到病毒Hexon的存在,提示CIK联合病毒治疗不影响病毒复制的特异性。结论CIK细胞联合表达IL-12基因的双靶向性溶瘤病毒Ad CN205-IL12具有协同抗肿瘤作用,发现溶瘤病毒的肿瘤裂解作用和肿瘤局部高浓度IL-12的表达增加了CIK细胞在肿瘤组织内的浸润数量,增强了CIK细胞的抗肿瘤作用,实现了“细胞-病毒-基因”强强联合的治疗效果。第二部分:CIK细胞运载Ad5/11嵌合型病毒靶向肝癌治疗的机制研究试验目的针对肝癌弥撒生长或广泛转移的特性,探讨CIK细胞运载Ad5/11嵌合型病毒实现血液系统给药的可行性,并研究病毒转载及转移的相关机制。实验内容及方法1.流式细胞技术检测CIK细胞表面CAR、αvβ5、αvβ3、CD46分子的表达情况;通过Ad5-CMV-GFP病毒感染CIK细胞,并检测细胞GFP阳性率研究5型病毒对CIK细胞的感染情况;2.通过Ad5-CMV-GFP-11F嵌合病毒感染CIK细胞检测细胞GFP阳性率研究Ad5/11型病毒对CIK细胞的感染能力;通过Texsa Red标记病毒于激光共聚焦显微镜下观察病毒结合CIK细胞的能力;3.通过Texas Red标记病毒,FITC标记CD46分子,研究病毒感染CIK细胞的过程与CD46分子的相关性;4.通过体外模拟CIK细胞在血液运输过程中受到的剪切作用,病毒感染CIK细胞后,通过10倍体积的PBS洗涤,再将洗涤后的CIK细胞与肿瘤细胞共培养,观察病毒转移情况;5.通过CIK细胞携带Ad CN205系统的溶瘤腺病毒,研究经CIK细胞携带的病毒是否保持感染、增殖和基因表达活力,以及体外抗肿瘤能力;体外检测CIK携带溶瘤病毒对肝癌Hu H-7细胞和PLC/RPF/5细胞的杀伤作用;6.通过Di O标记CIK细胞膜,Texsa Red标记病毒于激光共聚焦显微镜下观察病毒由CIK细胞转移至肿瘤细胞的过程;研究病毒转移过程与细胞膜的相关作用的关系;7.通过细胞松弛素D抑制细胞骨架运动,研究病毒转移过程与病毒骨架的运动的相关性;实验结果1.CIK细胞表面不表达CAR、αvβ5、αvβ3等与5型腺病毒感染相关的受体分子,而大量表达与11型腺病毒感染细胞相关的补体调节分子CD46受体;且5型腺病毒无法感染和吸附CIK细胞;2.Ad5/11嵌合型腺病毒可吸附于CIK细胞表面,在100MOI感染系数下对CIK细胞的感染效率可达到45.2±3.4%;Ad5/11嵌合型腺病毒可感染上皮来源的肿瘤细胞,感染效率与Ad5型病毒无差异;3.Ad5/11嵌合型腺病毒可在细胞表面引起极化作用,但病毒进入CIK细胞的能力有限;4.装载Ad5/11嵌合型腺病毒的CIK细胞与肿瘤细胞共培养后,病毒可由CIK细胞表面转移至肿瘤细胞;5.CIK可携带Ad5/11嵌合型瘤腺病毒并将病毒转移至肿瘤细胞,并保持溶瘤病毒的杀伤活性,对于Hu H-7细胞,72h时CIK细胞携带Ad CN205-GFP-11F组肿瘤细胞存活率显著低于单CIK组(p=0.0008),和CIK携带Ad CN205-GFP组(p=0.0168);对于PLC/RPF/5细胞,72h时CIK细胞携带Ad CN205-GFP-11F组PLC/PRF/5细胞存活率显著低于单CIK组(p﹤0.0001),和CIK携带Ad CN205-GFP组(p=0.005);6.Ad5/11嵌合型腺病毒由CIK细胞表面转移至肿瘤细胞依赖于CIK细胞与肿瘤细胞间膜的相互作用;7.通过细胞松弛素D抑制细胞骨架的运动可抑制病毒的转移过程;结论Ad5/11嵌合型腺病毒可感染和吸附CIK细胞,携带Ad5/11嵌合型腺病毒的CIK细胞通过CIK细胞与肿瘤细胞膜之间的相互作用将病毒转移至肿瘤细胞中,并保持病毒的生物学活性。