3-羟基丙酸(3-HP)是一种重要的平台化合物,也是一种重要的化学前体物质,具有进一步转化为有用化学物质的潜力,在工业、农业、医疗领域都有广泛应用。因此,美国能源部将3-HP列为12种最具开发潜力的可再生化工产品之一。在石油等不可再生资源日渐缺乏的今天,3-HP的需求日益增长。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种非常规酵母,因为Y.lipolytica广泛存在于生态系统(如土壤、海洋水域、菌根和石油污染环境等)和各种食物(特别是肉类和乳制品,包括奶酪)中且具有显著的分解脂肪的活性以及可以分泌脂肪和生产有机酸的特性,随着许多分子和遗传工具的发展,Y.lipolytica现已成为一个公认的表达外源基因和分泌相应蛋白的系统,已经成功地生产出来自80多个物种的130多种蛋白质。本论文选择在Y.lipolytica Polf菌株中构建丙二酸单酰辅酶A途径生产3-HP,由于Y.lipolytica的基因组中含有该途径涉及到的两个基因之一,乙酰辅酶A羧化酶合成基因(acc)。所以,需要将另一个基因丙二酰辅酶A还原酶合成基因(mcr)转入Y.lipolytica中。为了比较原始mcr基因和密码子优化合成的mcr基因的表达效果以及单拷贝质粒和多拷贝质粒的异源基因表达效果并尽可能的提高3-HP的产量,开展了以下研究:PCR扩增了原始mcr基因(命名为mcr1)和密码子优化合成mcr基因(命名为mcr2),分别与多拷贝质粒p INA1312和单拷贝质粒p INA1269无缝连接构建四种重组表达载体p1312-mcr1、p1312-mcr2、p1269-mcr1和p1269-mcr2。将它们转入Y.lipolytica Polf菌株中,构建并筛选获得四株可以生产3-HP的重组Y.lipolytica菌株YL(p1312-mcr1)、YL(p1312-mcr2)、YL(p1269-mcr1)、YL(p1269-mcr2)。液相色谱检测确定YL(p1312-mcr2)为最佳生产菌株,通过正交实验发现发酵温度对3-HP合成影响最显著,然后依次为p H、发酵时间、接种量。同时,最佳发酵条件为发酵温度30℃、p H值5.0、发酵时间84 h、接种量2.5%。发酵条件优化使3-HP的产量达到1.397 g/L,比优化之前提高了49.2%。