玫瑰苯丙素类物质转运相关候选基因筛选

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‘紫枝’玫瑰(Rosa rugosa‘Zizhi’)是一种重要的观赏性和经济性的园艺植物,其抗性优良、多季开花和芳香馥郁的特性使其在园林美化中有着独树一帜的地位。玫瑰花富含大量的芳香性物质和微量元素,有极好的美容养颜排毒功能,玫瑰精油更是有着“液体黄金”之称。苯丙素类物质是玫瑰花色花香的主要成分之一,通过苯丙氨酸代谢途径合成。ABC转运蛋白是自然界普遍存在的跨膜蛋白,参与到苯丙素类物质的跨膜转运之中。研究玫瑰苯丙素类物质转运机理对玫瑰色香品质改良具有积极的意义。本研究以玫瑰为主要研究材料,利用转录组分析、基因共表达网络构建等方法,初步筛选出与苯丙素类物质转运相关的ABCG候选基因。主要研究如下:1.本文首先通过对‘紫枝’玫瑰花瓣不同时期的转录组分析和基因共表达网络构建,筛选出与盛花期(Flower stage 4,S4)相关性高的模块内的基因共计794个。对这794个基因进行KEGG富集分析发现82个基因富集在苯丙氨酸通路,参与到玫瑰的苯丙素类物质合成。其次,使用基于隐马尔可夫模型的HMMER和基于序列相似性的blast,筛选‘紫枝’玫瑰中的ABC转运蛋白,再通过与已报导的Ph ABCG1蛋白和近缘物种中ABC转运蛋白构建的进化树,筛选出Rr ZZ_11690、Rr ZZ_40646和Rr ZZ_42661三个候选基因。然后,利用Port Param、SOPMA和Swiss Model分析这三个候选基因的蛋白结构,发现Rr ZZ_11690和Rr ZZ_40646的蛋白结构较为相似,而Rr ZZ_42661的蛋白结构与其它两个相差较大。随后,使用TMHMM软件确定候选ABCG转运蛋白的跨膜结构区域,初步推测这三个蛋白可能是跨膜转运蛋白。利用荧光定量PCR分析这三个候选基因在玫瑰不同花发育时期的表达情况,结果发现Rr ZZ_11690和Rr ZZ_40646基因在S4时期表达量最高,而Rr ZZ_42661在这个时期几乎不表达。对这三个候选转运蛋白的跨膜结构区域进行亚细胞定位分析,结果发现它们均定位在细胞膜。因此,我们初步筛选出与苯丙素类物质转运相关的ABCG候选基因Rr ZZ_11690和Rr ZZ_40646。2.PM转录因子是我们课题组前期人工合成的可以调控苯丙素类物质大量积累的MYB转录因子。我们通过对PM转基因玫瑰(Rosa rugosa‘Zizhi’)、草莓(Fragaria vesca)和番茄(Solanum lycopersicum)进行转录组分析,在玫瑰中筛选出5418个差异表达基因,在草莓中筛选出2789个差异表达基因,在番茄中筛选出822个差异表达基因。对这些差异基因进行GO富集发现转基因草莓和番茄在分子功能和生物过程的类别中差异较大,而转基因玫瑰在三个类别的差异都很大。KEGG富集分析,发现三个转基因物种中的差异表达基因都有在苯丙烷类生物合成通路富集。这些结果也说明了PM转录因子的确和苯丙素类合成调控相关。对PM转基因材料中的ABC转运蛋白进行差异表达分析,共发现玫瑰中50个,草莓中17个,番茄中2个ABC转运蛋白发生显著性的改变。其中在转基因玫瑰中Rr ZZ_11690和Rr ZZ_40646显著性下调表达。综合上述实验结果,我们获得了玫瑰花瓣不同时期的转录组数据,并对其进行相关分析富集出玫瑰盛花时期在苯丙氨酸代谢通路富集,通过对序列分析和初步实验验证筛选出Rr ZZ_11690、Rr ZZ_40646和Rr ZZ_42661三个候选基因。通过转PM植株转录组分析推测PM调控机理和其对ABC转运蛋白的调控。为玫瑰花色花香研究提供了新思路和基因资源。
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