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C4植物比C3植物具有更高的光合效率和同化效率,通过遗传转化手段将C4光合机制引入到C3植物中是增加作物产量的一种可能的途径。以往的研究多是将单一或少数C4途径基因转化到C3植物中以提高其光合效率,但效果往往并不十分理想。本文发展了多基因转化技术,并将多个c4途径基因导入属于C3光合类型的双子叶植物烟草和单子叶植物水稻中,以期改善C3植物的光合效率。
本研究建立了两套分别适用于单、双子叶植物的、可去除标记基因的多基因组装载体系统。该系统利用Cre/loxP特异性重组策略实现多个基因的组装,同时,还运用双T-DNA共转化法去除了筛选标记基因；此外,该系统引入了MAR序列,使得外源基因在植物中稳定表达。每套系统均由一个接受载体和两个供给载体组成。双子叶植物组装载体系统中接受载体的标记基因为NptⅡ基因,两个供给载体均含CaMV35S启动子和NOS终止子。单子叶植物组装载体系统与双子叶植物组装载体系统的不同之处在于其接受载体的筛选标记基因为HPT基因,两个供给载体均含有Ubiquitin基因启动子和NOS终止子。在此基础上,我们进一步对该系统进行了优化,以GFP作为辅助筛选基因,实现可视化筛选,在T1代筛选无选择标记植株的过程中,节省了大量的工作量和费用。
首先,我们从超级杂交稻两优2186中克隆了5个C4途径基因,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)、丙酮酸磷酸双激酶基因(PPDK)、NADP依赖型苹果酸酶基因(NADP-ME)、NADP依赖型苹果酸脱氢酶基因(NADP-MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸转运蛋白基因(PPT)和2个与光合作用密切相关的基因Rubisco活化酶基因(RCA)和Rubisco小亚基基因(RbcS),然后,利用多基因组装载体系统成功的构建了分别含有5个(PEPC、PPDK、NADP-ME、NADP-MDH、PPT)和7个基因(除上述5个外,还有RCA、RbcS)的双子叶植物表达载体pCDMAR-PKMHT-NptⅡ和pCDMAR-PKMHTRB-NptⅡ,并转化烟草。同时,还构建了含有4个基因(PEPC、PPDK、NADP-ME、NADP-MDH)的单子叶植物表达载体pCDMAR-PKMH-hyg,并转化水稻。
利用农杆菌介导的改良叶盘法,将载体pCDMAR-PKMHTRB-NptⅡ转化烟草,共获得20株独立来源的卡那抗性苗,其中,经Southern杂交证实有3株含有完整目的基因。对这3个株系T1代遗传分离分析表明,有1个(33.3％)株系C4光合基因与标记基因NptⅡ发生分离,成功的获得了无选择标记、转多基因植株；以含有载体pCDMAR-PKMHT-NptⅡ的农杆菌转化烟草,共获得18株独立来源的卡那抗性苗,其中,Southern杂交证实有5株含有完整目的基因,对这5个株系T1代遗传分离分析,这些株系中C4光合基因与标记基因NptⅡ未发生分离。进一步对T1代转基因烟草详细的分子检测表明,C4光合基因仍在子代中保持着结构完整性。以上结果表明利用该系统可成功获得无选择标记、多基因转化植物。
RT-PCR分析表明,在含有5个C4光合基因转基因的T0代5个株系中,有3个株系目的基因均有表达,其中NADP-MDH、PPT表达丰度较高,而PEPC、PPDK和NADP-ME表达丰度较低；在含有7个C4光合基因转基因的T0代3个株系中,有2个株系所有的目的基因也均有表达,其中NADP-MDH、PPT、RCA和RbcS表达丰度较高,而PEPC、PPDK和NADP-ME表达丰度较低。对上述株系的T1代植株进行表达分析,结果表明C4光合基因能够稳定表达,并且与T0代具有相同的表达模式。对T1代转基因植株的表型观察表明,水稻C4光合基因的导入没有引起烟草表型的明显变化。光合特性测定发现,转5个C4光合基因烟草具有较高的净光合速率,达20.03μmol·m-2·s-1,与非转基因植株的光合速率18.92μmol·m-2·s-1相比提高了5.86％；而转7个C4光合基因烟草的净光合速率略微偏低,为18.42μmol·m-2·s-1,与非转基因植株的光合速率18.92μmol·m-2·s-1相比下降了2.64％。我们并对上述实验结果进行了讨论。此外,利用农杆菌介导的遗传转化法将质粒pCDMAR-PKMH-hyg转化水稻明恢86,共获得48株独立来源的潮霉素抗性苗,通过PCR检测筛选到了4株含有4个C4途径基因的转基因水稻植株,研究工作仍在进行之中。
本文为利用转化多个C4途径基因改善C3植物光合效率的研究奠定了方法学的基础,对今后进一步提高C3植物的光合效率具有一定的借鉴意义。