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肿瘤的血管新生(angiogenesis)在肿瘤的生长、侵袭和转移中起着重要的作用。血管新生是一个复杂的多步骤的过程，包括血管内皮细胞的增殖(proliferation)、血管内皮细胞的趋化(chemotaxis)、血管内皮细胞在细胞外基质中管样结构的生成 (tubular morphogenesis)。研究证明阻断血管新生过程的一个或多个步骤，就有可能达到抑制血管生成的目的。通过抑制肿瘤内的血管新生，就可以抑制肿瘤的生长、侵袭和转移。由于这种治疗方案的靶目标定位在药物能够直接到达的血管内皮细胞上，所以药物用量较小，因此副作用也小。而且内皮细胞的基因较肿瘤细胞要稳定，不易产生耐药性。所以通过抗血管新生来治疗肿瘤是一个很有前途的治疗策略，它避免了传统化疗方案所导致的毒副作用大和肿瘤易耐药的问题，已经成为肿瘤治疗的新的研究热点。 五十年代有细胞毒性的化疗药物被提出用于治疗肿瘤。本着尽可能多地杀死肿瘤细胞的原则，临床上用最大耐受剂量(MTD，Maximum Tolerance Dose)来治疗病人。然而几十年的临床实践证明由于化疗药物的毒副作用和肿瘤耐药的产生，这种旨在杀伤肿瘤细胞的治疗方案并没有达到人们预期的目的。最近研究发现长春花碱、环磷酰胺、博来霉素等一些传统的化疗药物在改变了治疗方案后有抑制血管新生的作用。实验证明传 浙江大学硕士学位论文统化厅药物的抗血管新生方案能提高治疗肿瘤的效力。但这些药物的作用机理还不是恨清楚。本实验通过观察不同浓度的长春花碱对血管内皮细胞的增殖、血管内皮细胞的趋化、血管内皮细胞在细胞外基质中管样结构生成的作用，以此探索氏春花碱抑制血管新主的机理和合适的治疗剂量，为制定更完备的肿瘤治疗策略提供实验依据。实验方法：l 低浓度的长春花碱对血管内皮细胞增值的作用 主长良好的 ECV－304稀释成密度为 IX 10‘／ml的细胞悬液，以每孔 200微升的量加入96孔培养扳中，放入细胞培养箱温育24小时后分组处理。实验共分5组，每组共6个复孔。未加药组：正对照组：加药组：氏春花碱的浓度分别为of微克／升、2．5微克升、5微克／升、10微克／升。将 96孔培养扳放入细胞培养箱内温育 48小时。48小时后每孔加／＼5毫克’毫升的NITT20微升，放入细胞培养箱作用4小时后去上渭液，每孔加D卜ISO （二甲基亚矾）150微升，振荡10分钟，酶际仪490urn处读数。数据处理。二．低浓度的长春花碱对ECV－304趋化的影晌 生氏良好的 ECV－304用浓度分别为 0月微克／升、2、5 微克／升、5微克／升、10微克．升的长春花碱处理24小时。Bo｝den ／J’至的下室加入条件培养基，盖上覆有Matrteel（人工基匣膜）的硝酸纤维滤膜，上室帕入经不同浓度的长春花碱处理过和未经药物处理的纸胞悬液 400微升。将装配好的 Bo｝den小室放入细胞培养箱。温育 IZ小时后将硝酸纤维滤膜叹出，去除膜上面的细胞，然后将膜固定、染色、计数穿过膜的细胞数。3 低浓度的长春花碱对血管内皮细胞在Matrigel（人工基底膜）中管样结构生成的影响 浓度为 17g／L MatFbeel以每孔 250微升的量加入 24孔培养扳中，放入 37oC细胞培养箱聚合30分钟。生长良好的ECV．304稀释成密度为IX 10’／ml的细胞悬液，以每孔1M的量加入底部己铺有Matrigel的24孔培养扳中。实验分5组，每组共4个复孔：未加药组即正对照组：加药组：长春花碱的浓度分别为：0．lffi克／升、工5微克／升、5微克／升、 ．2－ 浙江大学硕士学位论文川微分升。随即将 24孔培养扳放入细胞培养箱温育 8小时。然后将 24孔培养饭拿出在倒宜显微镜下观察ECV－304管样结构生成的情况。结果：1 长春花碱抑制ECV－304增殖的敏感浓度范围 低浓度的长春花碱对EC＼／。304增值有影响，陋长春花碱的浓度的增加，其抑制EC＼’．304增殖的作用增加，呈剂量依赖关系。长春花碱抑为 ECV－304增值的敏’孪浓度在01 tA克’升到IO微克／升之间。庄这个范围内随着长春花碱i农度的增加，抑制＊CV刁N增值的幅度增加较明显。当长春花碱的浓度低于of 微克／升时，抑制作用不明显。当K春花碱的浓度达到10微克／升以后，其抑制增殖的作用不再明显增加，曲线趋向平缓。2 不同浓度的长春花碱对ECV－304增殖的抑制率 浓度为of微克／升、25微克升、5微克／升、川微克．’升的长春花碱对ECV扣4增值的抑制军分别为 9．8％、453 k、60．8 ？6、72．6 ％。各用药组与正对照组比较均有显著性差异（prt001）。3 长春花碱对ECV－304的细胞毒作用 当长春花碱的浓度逐渐增加时，长春花碱对细胞的毒性作用也越来越明显，当浓度达到10 rid克科后，可清楚地看到药物对细胞的毒性作用：细胞数量明显减少，细胞与细胞之间的连接消失，细胞由正常的梭形变成圆形，细胞肿胀，细胞的折光性增加，还可以见到明显的细胞碎片，大小不