低温限制植物的分布,生长发育和作物的产量。目前,对生长在高寒地区植物的研究主要集中在生理生化机制方面,而关于表观遗传修饰对高山植物生活适应性的调节机制知之甚少。高山离子芥作为典型的高山冰缘植物,在生长季会经常遭遇冰雹、降雪和大温差(-4~16℃)的天气,长期进化出独特的适应机制,是研究植物冷冻耐受的理想材料。本研究分析了自然生境下温度波动引起的高山离子芥基因组DNA甲基化及组蛋白修饰的变化,同时分析了不同冷冻胁迫处理引起的高山离子芥DNA甲基化的变化,筛选到差异富集基因,其中乙醇脱氢酶基因ADH1在冷冻处理下DNA甲基化富集变化明显。克隆了CbADH1全长并研究了冷冻处理下该基因的功能及表观遗传修饰情况,从表观遗传调控角度阐释了其在高山离子芥特殊的抗冻机制中的作用。主要的研究结果如下:1.发现了高山离子芥低温胁迫响应与表观遗传调控有关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理后,高山离子芥半致死温度LT50升高,耐冷性降低。Western-blot实验分析显示,自然生境下随着环境温度变化,高山离子芥组蛋白H3及其它共价修饰H3K4me3、H3K9ac、H35Kac和H3K27me3都发生了变化,说明表观遗传调控参与了高山离子芥低温胁迫响应。2.揭示了DNA甲基化作为高山植物适应复杂冷胁迫的快速和灵活的机制之一。利用简化基因组甲基化测序(MethylRAD-Seq)技术和甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析了不同冷冻条件下高山离子芥基因组DNA甲基化的变化,发现随着胁迫时间的延长DNA甲基化呈现不同的变化模式,表明DNA甲基化参与了高山离子芥低温胁迫响应,高山离子芥通过DNA甲基化快速变化调控冷响应基因的表达。3.确定了冷冻处理下受DNA甲基化调控的基因类别。对MSAP实验筛选得到的43个有差异的多态性片段,经数据库比对后得到34个不同基因,主要是一些功能蛋白,转座子,逆转录转座子和未知基因。利用染色质免疫共沉淀技术ChIP结合实时荧光定量PCR对三个候选基因乙醇脱氢酶(ADH1),UDP-葡糖基转移酶(UGT)以及多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)冷冻处理下DNA甲基化变化水平进行验证,结果显示三个基因的DNA甲基化均降低,其中CbADH1冷处理下表达量上升明显。4.阐明了CbADH1参与植物生长发育并响应多种非生物胁迫。利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了高山离子芥CbADH1并进行序列分析。多序列比对发现CbADH1基因5’端43个特异氨基酸影响其亚细胞定位,定位在细胞质膜和叶绿体。同时分析了CbADH1组织定位及多种胁迫下该基因表达量的变化。GUS染色实验显示CbADH1在各个组织中均有表达,幼叶居多,花粉粒中也有大量表达,说明其参与植物的生长发育。转录本定量实验表明CbADH1响应多种非生物胁迫。与过表达AtADH1植株相比,拟南芥和烟草中过表达CbADH1基因显著增强了植株骤冷耐受能力。利用co-localization,BiFC和Y2H实验分析其互作机制,结果显示CbADH1与乙烯响应转录因子CbERF75,组蛋白去乙酰化酶CbHDA6,丙酮酸脱羧酶CbPDC1以及UDP-葡糖基转移酶CbUGT73之间存在相互作用,说明CbADH1通过与其他蛋白互作来提高植株抗冻性。5.证实了冷胁迫下CbADH1基因表达受表观遗传修饰调控。染色质免疫共沉淀ChIP结合实时荧光定量PCR分析发现,冷处理下CbADH1基因表达升高伴随组蛋白H3缺失和修饰变化。冷处理下CbADH1启动子区和编码区发生组蛋白H3丢失,同时组蛋白H3K9ac修饰和H3K4me3信号分别在检测的所有区域和近端启动子区升高。冷处理不同时间RNA聚合酶II羧基末端结构域(C-terminal domain,CTD)第二位和第五位丝氨酸磷酸化结合程度不同,从而调控基因表达和延伸。重亚硫酸盐测序分析发现CbADH1基因DNA甲基化主要发生在CG位点。6.揭示了骤冷胁迫下ADH1主要影响与糖酵解和三羧酸循环相关的代谢物变化。定量PCR分析显示拟南芥4℃处理下AtADH1基因表达升高极显著(p<0.001)。与野生型比较,拟南芥adh1突变体植株半致死温度升高。对骤冷条件下拟南芥T-DNA插入突变体adh1代谢物变化进行分析,发现adh1缺失突变株系在骤冷胁迫下主要造成细胞内可溶性糖如蔗糖和氨基酸如天冬酰胺的代谢发生异常变化,说明ADH1通过影响代谢物变化参与植物冷冻响应。综上所述,本研究首次发现高山离子芥CbADH1能够提高植物抗冻性,并且其表达受表观遗传修饰调控。此研究结果不仅为阐明高山冰缘植物逆境耐受机制提供了新的视角和理论依据,而且有助于深入理解极端环境下高山冰缘植物进化的逆境适应性。