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研究背景日本血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病,主要流行于发展中国家。目前,在我国湖区5省和山区2省仍广泛流行。血吸虫病的快速诊断的研究对于传染源的监测,疫情的控制将起到积极作用。一般认为,血吸虫病现场应用的理想的诊断、筛查方法应具备以下特点:特异、敏感、价廉、简便、稳定和快速。我国血吸虫病的现场查病仍然以粪检(kato-katz法)和IHA(Indirecthemagglutination test)、凝集试验、ELISA等方法为主。由于粪检费时费力,阳性检出率较低,尤其在轻度流行区漏检率高,已不适宜于大面积疫区人群的筛查。目前的IHA、ELISA试剂,基于粗抗原而制备,易出现假阳性和交叉反应。因此,研究快速、特异性高、准确、成本较低、简便易行的新型诊断技术和诊断方法,已成为当前血吸虫病诊断迫切需要解决的问题。研究目的通过本室保存的pQE30/SjRPS4原核表达质粒,在大肠杆菌M15中诱导表达,经Ni-NTA柱纯化重组蛋白,对纯化产物进行免疫活性分析;建立基于均一重组蛋白抗原的间接ELISA方法,用于日本血吸虫流行区人群血清检测,为日本血吸虫病快速检测及流行病学筛查提供方法。研究方法1、大量表达并纯化日本血吸虫核糖体蛋白S4,对其诊断价值作初步鉴定。大量培养带有pQE30/SjRPS4质粒的M15大肠杆菌,IPTG诱导SjRPS4表达。用Ni-NTA树脂的FAST START COLUMN形式纯化带有6个组氨酸的重组目的蛋白,然后进行复性。通过BCA法测定纯化蛋白浓度。用Western blotting分析重组蛋白的免疫反应性。2、建立SjRPS4间接ELISA方法。用纯化的重组蛋白SjRPS4为包被抗原建立间接ELISA方法,并优化间接ELISA最佳工作条件和确定阴阳性标准对照。3、间接ELISA方法在血吸虫病流行区的现场应用。日本血吸虫病流行疫区汨罗市白塘乡中仁义村、双义村、大塘村和木屯村四个乡村采集日本血吸虫感染可疑病人血清。用间接ELISA方法与间接血凝方法同时检测104份血清,评价重组蛋白抗原在血清学诊断中的价值。研究结果1、SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,pQE30/SjRPS4质粒重组工程菌表达相对分子质量(Mr)约31ku的目的蛋白,在菌体细胞内主要以包涵体形式存在,表达的目的蛋白占菌体总量的20%-30%。用Ni-NTA柱纯化SjRPS4后得到纯度为95%以上的目的蛋白,Western blotting检测其能与日本血吸虫病人阳性血清发生特异性反应。2、以30μg/mL SjRPS4重组蛋白包被微孔板建立间接ELISA方法,阴阳性样品的临界值为0.122;检测16例肺吸虫病人阳性血清,无一例出现交叉反应。3、SjRPS4的间接ELISA方法在血吸虫病流行区的现场诊断,与IHA同时检测104份日本血吸虫病流行疫区的血清,敏感性为90.91%(70/77),特异性为92.59%(25/27),一致率为91.35%。结论1、大量表达并纯化了重组蛋白SjRPS4,并证实其具有良好的免疫反应性,能与日本血吸虫病阳性血清特异性结合,可应用于日本血吸虫感染血清学诊断。2、成功建立了以重组蛋白SjRPS4为包被抗原的间接ELISA法,在日本血吸虫病的免疫诊断中具有良好的应用价值。