PD-L1单链抗体的制备,诱导条件的筛选以及体外活性的初步鉴定

来源 :暨南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiaoge1011
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研究背景:随着医学发展,当前治疗肿瘤的方式已不仅限于手术、放化疗或者靶向性药物。免疫治疗作为一种新型的癌症治疗手段,经过这几年的发展,迎来了很大的研究进展,特别是PD-1(Programmed cell death protein 1)和PD-L1(Programmed cell death 1 ligand 1)抗体的研究成果尤为突出。免疫治疗抗体药物一般具有很高的亲和性与特异性,在黑色素瘤,霍奇金淋巴瘤、间皮瘤、胶质母细胞瘤等癌症的临床治疗上起到了突出的效果。然而抗体药物存在着免疫相关毒性不明确、药物代谢动力学和肿瘤微环境渗透不足等缺点,阻碍了抗体类药物在临床上的应用。在这背景下小分子抗体药物逐渐发展,由于小分子抗体分子量小,结构明确,能有效解决抗体类药物的不足。因此,研发更为优越的小分子抗体来弥补抗体药物本身的缺点是时下的热门研究之一。研究目的:本课题是为了制备出小分子PD-L1单链抗体蛋白,使其能在原核系统中进行表达。同时为了增加目的蛋白的可溶性表达,重点筛选合适的蛋白诱导条件,并对所提取的可溶性蛋白测定其生物活性。本课题为小分子免疫治疗药物的开发提供可靠的依据。研究方法:本实验通过NCBI网站分析并找到商业上取得巨大成功的人源Atezolizumab蛋白序列轻链的可变区(PDB:5X8L_K)以及重链的可变区(PDB:5X8L_F)。将它们翻译为核苷酸序列后,进行了E.coli密码子偏好性的优化。同时在序列上插入了原核Omp A信号肽序列(Gen Bank:KF041825.1),重新合成了PD-L1 scFv基因序列,克隆在含有T7启动子的p ET-28a+质粒中。我们提取了重组质粒,将其转化到BL21感受态细胞中诱导表达。并筛选有利于目的蛋白可溶性表达的条件,利用Ni柱对蛋白纯化。纯化后的PD-L1scFv蛋白经蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫荧光实验、细胞增殖实验来进行生物特性鉴定。研究结果:成功构建了PD-L1 scFv基因序列,序列符合E.coli密码子的偏好性。将重组p ET-28a+质粒转化至BL21感受态细胞后,探索出了最佳的诱导表达条件为:低温16℃,IPTG的最佳诱导浓度为0.2 m M,最佳诱导时长为7 h。此条件能可溶的表达PD-L1 scFv蛋白。经Ni柱纯化提取后PD-L1 scFv蛋白的产量约2.4 mg,产率约70.1%。纯化后的蛋白进行透析以及真空浓缩处理后,以终浓度为0.01μM,0.05μM,0.1μM,0.3μM分别与人乳腺癌细胞MDA-MB-231进行免疫荧光实验。在共聚焦显微镜下能观察到各浓度的PD-L1 scFv蛋白均能与人乳腺癌细胞表面结合。此外,我们还使用了CCK-8测定出了PD-L1 scFv蛋白对人正常肝细胞LO2无明显毒性。结论:本实验所合成的PD-L1 scFv核苷酸序列经过了大肠杆菌密码子偏好性的优化,能在原核表达系统中进行可溶表达。同时证明了纯化后的PD-L1 scFv蛋白具备与乳腺癌细胞表面的PD-L1相结合的生物活性,对人正常肝细胞LO2无明显的毒性。本实验为小分子免疫治疗药物的开发提供了可靠的依据。
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