草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属，含有分段的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)基因组，是一种由7种结构蛋白组成的双层衣壳无囊膜病毒，其中外衣壳由VP5和VP7两种蛋白组成。与囊膜病毒感染的膜融合机制不同，GCRV入侵宿主细胞的途径采用的是一种外衣壳蛋白VP5和VP7介导的膜穿透机制。低温电镜与三维重构数据显示，VP5和VP7在GCRV入侵宿主细胞时会发生一系列的动态构象变化，其VP7的降解引起VP5的自动裂解，从而形成具有感染性的中间亚病毒颗粒（infectious subvirion particle，ISVP）。基于GCRV分段的dsRNA基因组特性，实施反向遗传学操作存在一定的局限性，即目前尚无法从分子水平研究VP5和VP7在GCRV感染过程中所起的重要作用。因此，建立简便有效的研究VP5和VP7介导的膜穿透机制的方法，将为进一步研究GCRV入侵宿主细胞的机制提供重要的理论与实验依据。　　为了从分子水平探讨VP5和VP7介导的GCRV入侵宿主细胞的功能，本课题尝试在体外重组GCRV。基于GCRV颗粒结构特征及实验室已建立的重组杆状病毒表达系统，首先在昆虫细胞中获得了VP5和VP7高效共表达;并通过Native-PAGE与免疫共沉淀分析，证明了VP5和VP7能够分别形成多聚体形式并且二者之间存在很强的相互作用。此外，采用胰蛋白酶消化初步纯化的GCRV，通过氯化铯密度梯度离心纯化，得到纯净的GCRV核心。在上述基础上，将纯化的病毒核心与杆状病毒表达系统表达的VP5和VP7按照一定的化学计量比进行体外孵育，获得体外组装的重组病毒粒子(Recoated GCRV,R-GCRV)。经电镜观察、SDS-PAGE及Western blot检测等发现，采用密度梯度离心纯化的R-GCRV具有与野生型病毒粒子(Native GCRV,N-GCRV)相似的形态大小、蛋白组分等生物学特性;通过空斑测定及NH4Cl阻断实验分析，发现二者具有相似的感染性，提示R-GCRV与N-GCRV具有相同的感染途径。这些结果充分表明，可以通过体外组装的方法获得重组GCRV;其重组病毒也将为进一步研究GCRV外衣壳蛋白穿透宿主细胞膜的机制提供很好的实验模型。　　依据GCRV高分辨率三维结构解析数据，推测VP5 N42位可以发生自动裂解且对病毒的感染性起着重要作用。为了证实VP5 N42位自动裂解与GCRV入侵宿主细胞的相关性，将VP5 N端42位进行突变后与野生型(wild type，WT)VP7通过杆状病毒表达系统进行共表达，基于已建立的体外组装方法，将VP5N42A/VP7与纯化的GCRV核心进行体外孵育，获得了突变型重组病毒粒子(VP5N42A/VP7 R-GCRV)。Western blot分析发现，表达的突变体VP5N42A检测出一条完整的VP5片段，即未能发生自动裂解形成VP5N/VP5C片段;免疫共沉淀实验证明，表达的突变体VP5N42A与VP7之间仍然存在很强的相互作用;进一步病毒滴度测定发现，VP5N42A/VP7 R-GCRV的感染性较N-GCRV呈现明显的降低。这些结果表明，VP5 N端42位从Asn→Ala的突变明显地抑制了VP5的自动裂解，提示VP5 N端42位的自动裂解在GCRV感染过程中起到了关键的作用。　　为从另一角度揭示外衣壳蛋白介导的GCRV入侵宿主细胞的机制，本论文还建立了量子点标记GCRV的方法，以此通过可视化的方式示踪病毒入侵宿主细胞的过程。将纯化的GCRV通过一步化学反应，进行生物素化后加入链霉亲和素修饰的量子点进行结合反应，经再次纯化后得到纯净的量子点标记的病毒(Qdot labeled GCRV, Qdot-GCRV)。电镜及免疫荧光定位技术检测表明，量子点可以特异性地标记在生物素化的GCRV外衣壳上;进一步的荧光定量PCR和一步生长曲线实验分析证实，量子点标记对病毒的感染性没有显著的影响。此外，采用激光共聚焦显微镜定位和示踪技术，发现Qdot-GCRV可以清晰地呈现标记病毒与细胞相互作用的动态过程。上述结果表明，本论文建立的量子点标记方法可以实现对无囊膜病毒GCRV的无损伤标记及动态示踪，其结果也为下一步阐明病毒入侵宿主细胞的具体感染途径提供了坚实的实验基础。　　综上，本课题采用体外组装和量子点标记的方法从分子水平研究了外衣壳蛋白介导的GCRV入侵宿主细胞的机制。基于杆状病毒表达系统，获得VP5和VP7的高效共表达，并与纯化的GCRV核心实现了体外组装，由此证实了VP5 N42位自动裂解对GCRV的感染至关重要。此外，还建立了一种量子点标记GCRV并用于动态示踪的方法，采用激光共聚焦显微镜定位和示踪Qdot-GCRV。本研究清晰地呈现GCRV与宿主细胞相互作用的动态过程，为揭示外衣壳蛋白介导的GCRV入侵宿主细胞的机制提供了理论与实验依据。