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Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)是一组高度保守的、在动物机体内普遍存在的一类模式识别受体,通过特异性的识别病原相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs) 激活下游信号通路,从而诱导抗微生物分子、化学趋化因子、细胞因子和共刺激分子的表达来参与机体的免疫反应。为了解贵州省主要品种羊TLRs多态性信息,本研究以贵州黑山羊、贵州白山羊、黔北麻羊、波尔山羊和湖羊为研究对象,采用基因测序获得不同品种羊TLR1~TLR10基因的序列信息,分析筛选同种和不同种羊之间TLRs基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,预测错义突变位点突变前后蛋白质二级结构、蛋白质三级结构和蛋白质功能结构域的变化;应用TaqMan实时荧光定量PCR方法不同品种羊血液及肺脏中TLRs基因的转录水平进行检测,并分析不同品种羊同种TLRs基因和同种羊不同TLRs在同一组织中的转录水平差异,为研究不同品种羊免疫相关分子TLRs多态性与疫病易感性相关关系提供基础数据。 1.不同品种羊TLRs基因多态性研究:应用基因扩增、克隆、测序及序列分析技术获取贵州黑山羊、贵州白山羊、黔北麻羊、波尔山羊和湖羊血液样本TLRs基因序列和多态性信息,结果可见,4种山羊TLR1~TLR10基因同源性均在98.7以上,山羊与湖羊TLRs基因同源性在97.7%~99.8%之间;系统进化树分析结果显示TLR1~TLR10基因山羊与湖羊均在不同进化分枝。通过TLRs基因多态性分析可见,5种羊TLR1~TLR10基因共发现184个SNP位点,包含86个错义突变位点,其中山羊种内共发现28个SNP位点,包含9个错义突变位点,分布在TLR2、6、7、8、9基因;湖羊种内共发现78个SNP,包含44个错义突变位点。山羊种间发现78个SNP位点,包含33个错义突变位点,分布在TLR1~6基因。对错义突变位点进行蛋白质二级结构、蛋白质三级结构和蛋白质功能结构域分析,结果显示,山羊和湖羊TLR1~TLR10基因蛋白质二级结构均存在差异, 84个错义突变位点中,有80个错义突变位点造成了TLRs蛋白质二级结构的变化。TLRs基因TIR结构域蛋白质三级结构分析显示,山羊和湖羊TLR1、2和6基因有差异,山羊TLR2基因错义突变位点A1922G(Tyr→Cys)、山羊TLR5基因错义突变位点A2198G (Asn→Ser)和湖羊TLR7基因错义突变位点A3056G(Glu→Gly)突变后造成了TLRs TIR结构域蛋白质三级结构的变化;TLRs蛋白质功能结构域预测显示,山羊和湖羊TLR1、4、5、10基因具有差异,74个TLRs胞外结构域错义突变中,只有13个错义突变位点引起蛋白质功能结构域的变化。 2.不同品种羊TLRs表达多态性:本文基于羊TLR1~TLR10基因序列,分别设计特异性扩增引物和探针引物,构建检测TLRs mRNA的实时荧光定量PCR方法,并应用所建方法对5个品种羊血液样本和肺脏样本TLRs转录水平进行检测,分析不同品种羊TLRs转录水平多态性。结果可见,本文建立的10个实时荧光定量PCR方法能用于羊TLR1~10转录水平定量检测,均具有良好的稳定性。TaqMan 实时荧光定量 PCR 法对羊TLR1~TLR10转录水平检测结果可见,5个品种羊50份血液样本和50份肺脏样本中均检测到了TLR1~TLR10的转录。湖羊血液样本中TLR1转录水平极显著的高于其余4种山羊( P<0.01 );贵州白山羊肺脏样本TLR1转录水平极显著的高于其余4种羊(p<0.01)。贵州白山羊、黔北麻羊和湖羊血液样本TLR2转录水平极显著高于其他2种羊(p<0.01);4种山羊肺脏样本TLR2转录水平极显著高于湖羊(p<0.01)。湖羊血液样本TLR3转录水平极显著高于其他4种羊(p<0.01);4种山羊肺脏样本TLR3转录水平显著高于湖羊(p<0.01)。贵州白山羊血液样本TLR4转录水平极显著高于其他4种羊(p<0.01),4种山羊肺脏样本TLR4转录水平极显著高于湖羊(p<0.01)。贵州白山羊和黔北麻羊血液样本TLR5转录水平极显著高于其余3种羊(p<0.01);黔北麻羊肺脏样本TLR5转录水平极显著高于其余4种羊(p<0.01)。贵州白山羊和波尔山羊血液样本TLR6转录水平极显著高于其余3种羊(p<0.01);贵州黑山羊、黔北麻羊和波尔山羊肺脏样本TLR6转录水平极显著高于其余2种羊(p<0.01)。贵州白山羊血液样本TLR7转录水平极显著高于其余4种羊(p<0.01);波尔山羊肺脏样本TLR7转录水平极显著高于其余4种羊(p<0.01)。贵州白山羊血液样本TLR8转录水平极显著高于其余4种羊(p<0.01);黔北麻羊肺脏样本TLR8转录水平极显著高于其余4种羊(p<0.01)。贵州白山羊血液样本TLR9转录水平极显著高于其余4种羊(p<0.01);贵州白山羊血液样本TLR9转录水平极显著高于其余4种羊(p<0.01);黔北麻羊肺脏样本TLR9转录水平显著高于波尔山羊(p<0.05),极显著高于其余3种羊(p<0.01)。波尔山羊血液样本及肺脏样本TLR10转录水平均极显著高于其余4种羊(p<0.01)。整体来说,血液样本TLR2、4、7、8转录水平较高,肺脏样本TLR2、3、4、5、8具有较高转录水平。 综上所述,羊TLRs基因具有丰富的多态性,其中山羊种内和种间共发现106个SNP位点,其中42个位点为错义突变位点,共16个错义突变位点引起相应Toll样受体二级结构、三级结构和功能结构域多态性;不同品种羊TLRs在血液样本及肺脏样本中均有表达且具有多态性。血液样本TLR2、4、7、8转录水平较高,肺脏样本TLR2、3、4、5、8具有较高转录水平。波尔山羊血液样本TLR2、4、5、7、8转录水平要低于其他4种羊,贵州白山羊血液样本TLR4、8、9转录水平显著高于其他4种羊;黔北麻羊肺脏样本TLR5和TLR8转录水平要高于其他4种羊,湖羊肺脏样本中TLR2、3、4、5、6、8、9转录水平要低于其他4种山羊。