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犬流感（canine influenza,CI）是由正粘病毒科A型流感病毒属犬流感病毒（canine influenza virus,CIV）引起的一种犬属动物的接触性呼吸道传染病。主要引起犬的发热、咳嗽、打喷嚏、食欲减退、精神沉郁等临床症状,严重感染时可引起呼吸系统衰竭甚至死亡。犬虽然是CIV的天然宿主,但是由于流感病毒的高度变异性使其可以跨宿主传播,从而给人类的健康和生活带来潜在的风险。目前,已有犬感染CIV的研究报道,但是CIV在犬体内持续感染及导致犬死亡的机制尚不清楚。本研究首先采用二代测序技术,对感染H3N2和H5N1亚型的幼犬,分别在感染第三天和第七天,采集气管和肺脏组织,建立转录组和mi RNA数据库,并运用生物信息学技术对差异基因进行分析。结果发现,CIV感染幼犬后,共检测到455个mi RNA和22516个m RNA,通过生物学分析,发现这些基因主要参与免疫和信号传导相关的通路调节。此外,通过对不同感染组之间比较,联合H3N2和H5N1数据分析,共发现有151个差异表达的基因,这些基因与机体免疫反应有关,并参与调节细胞因子受体间的相互作用、A型流感病毒和RIG-I样受体通路,而且参与生物调节、信号传导和免疫系统等生物过程。天然免疫组成宿主的第一道防线来抵抗病原体的侵入,其中干扰素调节的天然免疫发挥重要作用。转录组学结果表明,CIV感染能影响Toll样受体和RIG-I样受体调节的天然免疫反应。MDA5是RIG-I样受体的一种,病毒感染宿主后,MDA5通过识别配体激活干扰素,使机体产生抗病毒反应。为研究MDA5基因在CIV感染中的作用,首先对MDA5进行组织分布研究发现,结果发现MDA5主要分布在犬脾脏、肝脏和肺脏等组织中;进一步对MDA5基因结构进行研究,发现MDA5基因的蛋白序列与猫的同源性相近,结构预测发现犬MDA5主要由CARD结构域、RD结构域和DEx D/H解螺旋结构域组成。为验证MDA5发挥功能的区域,成功克隆出犬的MDA5全基因序列和MDA5的各个功能域序列（p3x FLAG-MDA5、p3x FLAG-MDA5-CARD、p3x FLAG-MDA5△CARD+RD、p3x FLAG-MDA5△RD和p3x FLAG-MDA5△CARD）,大小分别为:3087 bp、603 bp、2103 bp、2706 bp和2485 bp。运用IFA和Western Blot的方法对其进行表达验证。为探究犬MDA5基因对信号通路的调节作用,首先通过双荧光素酶实验,发现MDA5基因的CARD区能较强的激活IFN-β启动子（p<0.001）,并且MDA5主要是通过CARD区向下游传导信号。过表达MDA5的CARD区,发现MDA5介导的信号通路可以通过激活IRF3和NF-κB启动子向下游传导信号,且激活IRF3的能力更强。对MDA5进行特异性功能沉默后,机体细胞因子的产生降低,抗病毒活性减弱,而且流感病毒的复制能力增强,说明MDA5主要通过CARD区域抑制CIV病毒的复制。另外,MDA5的CARD区域能够显著激活另外两个模式识别受体LGP2和RIG-I的表达,且CARD区域能够激活RIG-I样通路及其下游的ISGs通路,促进抗病毒蛋白的表达和细胞因子的释放,从而发挥抑制病毒复制的功能。流感病毒蛋白和宿主之间的相互作用,决定了病毒在不同宿主中的适应性和致病性,而且病毒蛋白能够通过与宿主蛋白相互作用而逃避宿主免疫。为进一步探究MDA5基因对流感病毒的作用机制,本文通过Bi Fc和Co-IP实验,发现MDA5能够与v RNPs发生相互作用,而且PB2和NP与MDA5相互作用产生的Bi Fc信号主要定位在细胞核。此外,Bi Fc实验还发现MDA5能与流感病毒的NS1蛋白产生相互作用。NS1蛋白能够通过与ds RNA结合来抑制干扰素的表达,而且NS1蛋白能通过增强病毒蛋白的合成或者阻止细胞m RNA的翻译来影响病毒的复制。为探索NS1蛋白对MDA5的作用,首先验证NS1蛋白对v RNPs和MDA5相互作用的影响。分别共转染NS1和v RNPs基因,结果发现NS1对病毒v RNPs的表达没有明显影响。为进一步验证NS1蛋白对MDA5的作用,本文通过构建真核表达NS1基因并利用反向遗传技术,来分析NS1对MDA5所调节通路的作用。通过双荧光素酶实验发现,CIV的NS1蛋白能够拮抗MDA5的CARD区域对干扰素和IRF3启动子的激活作用,而且CIV的NS1蛋白对MDA5的CARD结构域调节的RIG-I通路和下游的ISGs基因也有拮抗作用。说明NS1能够通过MDA5基因来调节病毒的复制。综上所述,本文建立了高致病性H5N1和低致病性H3N2 CIV的转录组数据库;探究了H5N1 CIV和H3N2 CIV感染比格犬后在不同病程中,宿主m RNA和mi RNA表达谱的差异性,并对差异基因进行了信息学分析;发现了不同mi RNA与病症相关m RNA的相互关系,具有重要的生物学价值。此外,本文通过克隆犬的MDA5基因,并对MDA5基因的各个功能域验证,发现MDA5主要通过CARD区域发挥抗病毒功能,而且能与v RNPs产生相互作用。同时发现CIV能够通过NS1蛋白来拮抗MDA5调节的信号通路,以此来逃避天然免疫。本文为流感病毒的防控提供了理论支持,并为进一步研究流感病毒与宿主天然免疫的关系提供了思路。