草莓镶脉病毒中国分离物全基因组结构特征及其ORF VI基因功能鉴定

来源 :安徽农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:huli890615
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本研究测定了草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)中国分离物的全基因组序列,并依据SVBV美国分离物序列中各ORF的特征,确定了SVBV中国分离物编码的6个ORF在其基因组中的准确位置。进一步根据SVBV中国分离物全序列克隆了6个ORF的完整序列,为后续SVBV功能基因研究提供了必需的序列资源。本研究还将SVBV中国分离物中的致病因子ORF VI转入拟南芥,观察ORF VI对拟南芥症状表型的影响。1. SVBV中国分离物全基因组序列的测定及其序列分析用CTAB法从已感染SVBV中国分离物的草莓叶片中提取总DNA,根据SVBV美国分离物已知序列,设计特异性引物分段扩增了SVBV中国分离物全基因组各部分片段,克隆并测序,序列拼接获得SVBV中国分离物全长基因组,基因组长7838bp。将其与花椰菜花叶病毒属其他成员以及SVBV美国分离物进行序列比对,结果发现,SVBV中国分离物与SVBV美国分离物相似性最高,达86.14%。再根据SVBV美国分离物各ORF特征,进一步确定了SVBV中国分离物6个ORF在其基因组中的准确位置,将其与花椰菜花叶病毒属其他成员对应的各个ORF进行序列比对,并构建了各ORF的系统关系树。2. SVBV中国分离物各个ORF的克隆根据拼接的SVBV中国分离物全基因组序列,在其编码的各个ORF上下游设计特异性引物,分别扩增SVBV中国分离物各ORF的完整片段,克隆并测序,和拼接的SVBV中国分离物基因组序列比较并校对,保存测序正确的各ORF克隆。3. ORF VI植物表达载体的构建及以根癌土壤杆菌介导转化拟南芥将SVBV中国分离物ORF VI插入植物表达载体pCAM2300,构建重组植物表达载体pCAM P6。pCAM P6以根癌土壤杆菌介导转化拟南芥,经抗性筛选,获得T0代转基因拟南芥植株。症状观察发现ORF IV转基因拟南芥症状表型与非转基因拟南芥植株无明显差异。
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