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背景和目的卵巢癌作为妇科三大恶性肿瘤之一,其死亡率远远超出宫颈癌和子宫内膜癌,位居妇科恶性肿瘤之首。其具有起病隐匿,病程短,易早期侵袭、转移等特点,目前虽应用手术、化疗等治疗方法,但其长期生存率却无明显改善。因此寻找有效的抑制卵巢癌发生发展的基因治疗靶点成为其研究的热点。肝癌缺失基因-1(deleted in liver cancerl, DLC1)位于人类染色体8p21.3-22区域上,在多种肿瘤中通过杂合性缺失和(或)启动子甲基化而低表达或不表达。DLC1蛋白为Rho GTP酶活化蛋白(Rho GTPase activatiog protein, Rho GAP),主要通过其Rho GAP区域调控Rho蛋白(RhoA, Cdc42)及其下游效应因子活性,抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。在人肝癌细胞中DLC1导致FAK(Y925)去磷酸化,通过抑制Ⅰ(?)AK-Ras-MAPK通路,抑制肿瘤细胞增殖和转移能力。JNK蛋白在卵巢癌中通过调控核转录因子AP-1的表达,参与卵巢癌的发生与发展。目前关于DLC1基因与卵巢癌增殖和迁移关系,及DLC1与FAK、JNK的关系的报道尚少。该研究采用脂质体介导的基因转染技术,将重组质粒pEGFP-C3-DLC1和空质粒pEGFP-C3分别转染不表达DLC1基因的人卵巢癌细胞OVCAR-3,观察DLC1基因对卵巢癌细胞增殖、细胞周期和迁移能力的影响及其相关分子机制,初步探讨其在卵巢癌发生发展中的作用,及其作为卵巢癌基因治疗靶点的意义。方法1提纯重组质粒pEGFP-C3-DLC1,双酶切鉴定质粒的正确性。采用脂质体介导重组质粒pEGFP-C3-DLC1及空质粒pEGFP-C3转染人卵癌癌细胞OVCAR-3;实验分三组：OVCAR-3组,OVCAR-3-EGFP组和OVCAR-3-DLC1组。G418筛选单克隆后,采用RT-PCR及Western blotting方法检测转染前后三组细胞DLC1mRNA和蛋白的表达情况,观察转染效果；2采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞仪和Transwell小室分别观察转染前后三组OVCAR-3细胞增殖、细胞周期和迁移能力的变化,分析DLC1基因对OVCAR-3细胞增殖和迁移能力的影响；3采用Western blotting技术检测转染前后三组OVCAR-3细胞中FAK、JNK蛋白及其磷酸化水平的变化,分析DLC1基因发挥作用的分子机制；4应用SPSS16.0软件进行统计学分析,计量资料多组间均数差异性比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及bonferroni(?)去检验。计量资料相关性分析行Pearson(?)目关性分析。以双侧α=0.05为检验水准。结果1双酶切鉴定重组质粒出现4.7Kb和3.9Kb两条特异性条带,分别为pEGFP-C3和DLC1cDNA,证明插入序列正确。在OVCAR-3细胞中未见DLC1mRNA和DLC1蛋白表达,转染DLC1基因后可检测到DLC1 mRNA和DLC1蛋白的稳定表达。2转染DLC1基因后OVCAR-3-DLC1组细胞体外增殖能力自第2天起均低于其余两组,差异具有统计学意义(P<0.05),在培养6天后OVCAR-3-DLC1组细胞的A492值为0.503±0.022,与OVCAR-3-EGFP(1.106±0.031)、OVCAR-3组(1.132±0.045)相比,F=1604.000,P=0.000,差异具有统计学意义。3流式细胞检测细胞周期结果显示：OVCAR-3、OVCAR-3-EGFP、OVCAR-3-DLC1细胞的细胞周期G0/G1期、S期、G2/M期的比例分别为(55.06±0.73)%、(23.24±0.42)%、(23.60±0.46)%,(56.22±0.51)%、(18.96±0.35)%、(23.77±0.57)%和(61.40±0.75)%、(17.10±0.44)%、(21.50±0.20)%,三组之间差异具有统计学意义(F=126.151,P=0.000；F=1619.000,P=0.000；F=25.052,P=0.001)。OVCAR-3-DLC1组细胞与其他两组相比G0/G1期细胞比例显著增加,S期比例显著降低。4 Transwell法细胞迁移实验结果显示：OVCAR-3-DLCl、OVCAR-3-EGFP和OVCAR-3组穿过滤膜孔的细胞分别为(40.27±2.15)、(56.80±2.04)、(57.07±3.01),三组之间差异具有统计学意义(F=233.13,P=0.00)。OVCAR-3-DLC1组细胞的迁移细胞数显著少于两对照组。5 OVCAR-3-DLCl、OVCAR-3-EGFP和OVCAR-3三组细胞中p-FAK(Y925)、p-JNK(Thr183/Tyr185)蛋白相对表达量分别为0.63±0.06,0.70±0.05,0.72±0.04；1.78±0.11,2.37±0.11,2.41±0.15,在OVCAR-3-DLC1组中两蛋白的表达量显著低于两对照组(F=9.186,P=0.001；F=93.729,P=0.000),差异具有统计学意义。但1(?)AK、JNK蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05),差异无统计学意义。6采用Pearson相关性分析表明p-FAK、p-JNK与OVCAR-3细胞增殖(r=0.41,P=0.02；r=0.39,P=0.03)和迁移(r=0.36,P=0.04；r=0.37,P=0.03)能力显著相关,但与OVCAR-3细胞周期无明显相关性(r=-0.08,P=0.77；r=-0.00,P=1.00)。结论1 DLC1基因可部分通过G1/S检验点起阻滞作用,从而抑制卵巢癌细胞的体外增殖能力。2 DLC1基因可抑制卵巢癌细胞体外迁移能力。3在卵巢癌细胞中DLC1蛋白可通过使p-FAK(Y925)、p-JNK(Thr183/Tyr185)蛋白脱磷酸化,抑制卵巢癌细胞体外增殖和迁移能力,其可能通过其他信号通路参与细胞周期进展。