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第一部分P22phox基因敲除小鼠的培育及表型目的:P22phox是NADPH氧化酶的重要调节亚基,参与细胞内ROS的生成及细胞代谢的改变。在本实验组前期实验发现PDAC组织中P22phox表达水平明显上调。为探究P22phox在PDAC发生发展中的作用与机制,本实验使P22phox编码基因(CYBA基因)在胰腺腺泡细胞中特异性敲除,构建f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-基因型小鼠,并鉴定小鼠基因型。此外,我们培育f ElasCre ERT小鼠和f ElasCre ERT;p22phox-/-小鼠并鉴定其基因型与表型,探究在胰腺腺泡细胞中特异性敲除P22phox基因后是否会对小鼠胰腺的正常发育产生影响。方法:将f ElasCre ERT小鼠与KrasG12D/+小鼠杂交培育出可诱导的胰腺癌小鼠模型f ElasCre ERT;KrasG12D/+。再将f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠与P22phox-/-小鼠杂交,培育出f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-基因型小鼠。所有小鼠在2-3周龄时剪取小鼠尾巴末端,提取DNA,通过PCR扩增法和凝胶电泳鉴定小鼠基因型。在目前已知的所有研究中,本课题组是第一个将P22phox编码基因在胰腺腺泡细胞中进行敲除。为进一步确定P22phox在腺泡细胞中被完全敲除,我们提取150天龄f ElasCre ER小鼠和f ElasCre ER;P22phox-/-小鼠胰腺腺泡细胞来比较两组小鼠胰腺腺泡细胞中P22phox蛋白表达情况。f ElasCre ERT小鼠和f ElasCre ERT;P22phox-/-小鼠在150天龄时处死并提取胰腺组织进行病理学检测,判断各组小鼠胰腺表型。结果:通过PCR扩增法和凝胶电泳我们确认得到目的基因型小鼠。f ElasCre ER小鼠腺泡细胞中P22phox蛋白高表达而f ElasCre ER;P22phox-/-小鼠腺泡细胞中无P22phox蛋白表达。150天龄的f ElasCre ERT小鼠和f ElasCre ERT;P22phox-/-小鼠胰腺组织均发育良好,无腺泡损伤,炎症及间质纤维化沉积等病理改变。结论:我们成功培育出f ElasCre ERT;KrasG12D/+;p22phox-/-基因型小鼠。胰腺腺泡细胞中特异性敲除P22phox编码基因后,小鼠能正常生存,胰腺组织也能够正常发育。这为我们后续利用f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-基因型小鼠探讨P22phox在KrasG12D/+驱动的胰腺癌发生发展中发挥的作用奠定基础。第二部分P22phox敲除对KrasG12D突变协同高脂饮食诱导胰腺导管腺癌的影响目的:比较正常饮食和高脂饮食处理后KrasG12D/+小鼠的胰腺病理改变情况。探究胰腺腺泡特异性敲除P22phox编码基因对KrasG12D/+协同高脂饮食诱发的胰腺导管腺癌发生发展的影响。方法:f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠在70天龄时用Tamoxifen诱导后分成两组,一组进行普通饮食饲养,另一组进行高脂饮食饲养。当小鼠达150天龄时处死,取小鼠胰腺组织做H&E染色来评估不同饮食处理的小鼠胰腺组织病理改变情况。取f ElasCre ERT小鼠、f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠和f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠,70天龄时用Tamoxifen诱导后给予高脂饮食。一部分小鼠在150天龄时处死取胰腺组织进行病理学检测,评估各组小鼠胰腺病理改变,包括胰腺Pan IN病变程度,炎症水平,细胞增殖水平,胰腺星状细胞激活及间质纤维化情况。另一部分小鼠不加干预观察直至死亡,比较各组小鼠的生存时间是否存在差异。结果:150天龄普通饮食和高脂饮食处理下的f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠胰腺组织H&E染色结果可见高脂饮食组的f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠胰腺病变情况明显比正常饮食组严重。普通饮食组的f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠胰腺组织仅出现Pan IN-1,Pan IN-2改变;而高脂饮食组的f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠胰腺中出现高级别Pan IN改变,甚至部分进展成胰腺导管腺癌(10只小鼠中3只进展成胰腺导管腺癌)。高脂饮食处理下的f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺病变程度较f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠明显减轻。f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺组织中Amylase、MIST1的表达较f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠显著升高,而Alcian Blue,MUC5,α-SMA,Ck19,SOX-9,Sirus Red这些胰腺损伤的指标明显表达下降。从细胞增殖水平来说,f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺组织中Ki67阳性染色部分较f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠明显减少。从胰腺炎症水平来看,高脂饮食处理的f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠胰腺组织有明显的CD45和F4/80表达,而在f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺组织中CD45和F4/80的表达明显减少。结论:单纯的癌基因KRAS突变能引发胰腺损伤但不足以致癌。高脂饮食能有效促进KrasG12D/+的致癌作用。在小鼠胰腺腺泡细胞中特异性敲除P22phox编码基因能在一定程度上抑制KrasG12D/+协同高脂饮食的致癌作用。第三部分P22phox基因敲除抑制KrasG12D突变诱导胰腺导管腺癌的机制研究目的:探究胰腺腺泡特异性敲除P22phox能够抑制KrasG12D/+协同高脂饮食的致癌作用的机制。方法:提取70天龄时Tamoxifen诱导后进行经高脂饮食处理的150天龄的f ElasCre ERT小鼠、f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠和f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺组织蛋白。利用蛋白免疫印迹法检测各组小鼠胰腺组织中糖酵解关键限速酶HKII和LDHA的蛋白含量。利用Ras Activation Assay Kit检测各组小鼠胰腺组织中具有活性的RAS蛋白(RAS-GTP)含量。利用免疫印迹法检测RAS下游ERK信号通路的激活水平及HIF-1α的表达情况。结果:在高脂饮食处理下f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠胰腺中HKII和LDHA的表达较对照组f ElasCre ERT小鼠明显升高。而f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺中HKII和LDHA表达较f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠显著降低。高脂饮食刺激后的f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠胰腺中具有活性的RAS蛋白占总RAS的百分比显著增高,其下游的ERK通路激活水平也明显升高,ERK信号通路调控的HIF-1α在胰腺中的表达水平也随之增高。相比于f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠,f ElasCre ERT;KrasG12D/+;P22phox-/-小鼠胰腺中具有活性的RAS蛋白占总RAS的百分比,ERK通路激活水平及HIF-1α蛋白的表达均有明显降低。结论:高脂饮食处理的f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠胰腺中HKII和LDHA水平升高说明小鼠胰腺细胞的代谢方式发生转变,产能途径由正常的氧化磷酸化向糖酵解转换,这一现象符合Warburg效应,也是肿瘤细胞的主要特征。f ElasCre ERT;KrasG12D/+小鼠胰腺细胞代谢方式的变化可通过RAS/ERK/HIF-1α通路来调节。在胰腺腺泡细胞中特异性敲除P22phox后可通过降低细胞内ROS水平来抑制RAS的激活,阻断RAS/ERK/HIF-1α通路,进而抑制胰腺细胞的代谢网络重构,延缓疾病进展。