CXXC5表达变化对小鼠肺成纤维细胞分化及Wnt/β-catenin信号通路的影响

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研究目的明确离体小鼠肺成纤维细胞中CXXC5的表达情况及Wnt/β-catenin信号通路的活化情况。明确TGF-β1刺激下,小鼠离体肺成纤维细胞CXXC5表达变化及Wnt/β-catenin信号通路的活化情况。探究CXXC5表达变化在TGF-β1刺激的小鼠离体肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的影响及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。研究方法构建带有荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-GFP)、目的基因CXXC5腺病毒载体(Ad-CXXC5)、靶向CXXC5的特异性shRNA腺病毒载体(Ad-shRNA-CXXC5)。体外培养小鼠肺成纤维细胞。实验分组:共8组:(1)对照组包括cell组、Ad-GFP组、Ad-CXXC5组、Ad-shRNA-CXXC5组;(2)处理组包括TGF-β1组、TGF-β1-Ad-GFP组、TGF-β1-Ad-CXXC5、TGF-β1+Ad-ShRNA-CXXC5组。用三种腺病毒载体感染对数生长期的小鼠肺成纤维细胞,探索最佳感染率。CCK-8法、流式细胞术检测各组细胞的增殖及凋亡;qPCR检测各组细胞CXXC5、β-catenin、proCollaI,proColla III,α-SMA mRNA的表达;Western blot检测CXXC5、β-catenin、Dvl蛋白、Vimentin、Fibronectin、α-SMA蛋白的表达。ELISA检测各组细胞上清液中Col1aI、Col1a III的含量。研究结果Ad-GFP、Ad-CXXC5、Ad-shRNA-CXXC5的最佳感染效率(MOI)为100。CCK-8及流式细胞术检测结果显示:与Ad-GFP组相比,Ad-CXXC5组细胞增值率减低、凋亡增加,Ad-shRNA-CXXC5组细胞增殖率增加,凋亡减少。与cell组相比,TGF-β1组成纤维细胞增殖增加、凋亡减少。与TGF-β1-Ad-GFP相比,TGF-β1-Ad-CXXC5组CXXC5过表达减弱了TGF-β1对成纤维细胞的促增殖、抑制凋亡作用,TGF-β1+Ad-ShRNA-CXXC5组中CXXC5沉默表达与TGF-β1作用叠加,共同促进细胞增殖、抑制凋亡。RT-qPCR检测结果显示:(1)与Ad-GFP组相比,Ad-CXXC5组CXXC5 mRNA表达增加,Ad–shRNA-CXXC5组CXXC5 mRNA表达减少。与cell组相比,TGF-β1刺激下TGF-β1组CXXC5 m RNA表达均减少。(2)与Ad-GFP组相比,Ad-CXXC5组proCollaI mRNA、proCollaIII m RNA、α-SMA mRNA表达减少,Ad-shRNA-CXXC5组表达增加。与cell组相比,TGF-β1组在TGF-β1刺激下proCollaI mRNA、proCollaIII mRNA、α-SMA mRNA表达均增加。与TGF-β1-Ad-GFP相比,TGF-β1-Ad-shRNA-CXXC5组CXXC5下调协同TGF-β1促进细胞proCollaI m RNA、proCollaIII mRNA、α-SMA m RNA的表达,而TGF-β1-Ad-CXXC5组CXXC5过表达可减弱TGF-β1的以上作用。(3)与Ad-GFP组相比,Ad-CXXC5组β-CateninmRNA明显减少,Ad-shRNA-CXXC5组β-Catenin m RNA表达量明显增加。与cell组相比,TGF-β1组在TGF-β1刺激下细胞β-Catenin mRNA表达增加。与TGF-β1-Ad-GFP相比,TGF-β1-Ad-shRNA-CXXC5组CXXC5表达下调协同TGF-β1作用促进细胞β-CateninmRNA的表达。TGF-β1-Ad-CXXC5组显示CXXC5过表达可减弱TGF-β1的上述作用。4、Western blot检测结果显示:(1)与Ad-GFP组相比Ad-CXXC5组CXXC5蛋白表达增加,Ad-shRNA-CXXC5组CXXC5蛋白表达减少。与cell组相比,TGF-β1组CXXC5蛋白表达减少。(2)与Ad-GFP组相比,Ad-CXXC5组Vimentin、Fibronectin、α-SMA蛋白表达减少,Ad-shRNA-CXXC5组表达增加。与cell组相比,TGF-β1组Vimentin、Fibronectin、α-SMA蛋白表达均增加。与TGF-β1-Ad-GFP相比,TGF-β1-Ad-shRNA-CXXC5组CXXC5下调协同TGF-β1促进细胞Vimentin、Fibronectin、α-SMA蛋白的表达,而TGF-β1-Ad-CXXC5组CXXC5过表达可减弱TGF-β1的以上作用。(3)与Ad-GFP组相比,Ad-CXXC5组β-Catenin、Dvl蛋白量明显减少,Ad-shRNA-CXXC5组β-Catenin、Dvl蛋白表达量明显增加。与cell组相比,TGF-β1组在TGF-β1刺激下细胞β-Catenin、Dvl蛋白表达均增加。与TGF-β1-Ad-GFP相比,TGF-β1-Ad-shRNA-CXXC5组CXXC5表达下调协同TGF-β1作用促进细胞β-Catenin、Dvl蛋白的表达。TGF-β1-Ad-CXXC5组显示CXXC5过表达可减弱TGF-β1的上述作用。5.ELISA检测结果显示:与Ad-GFP组相比,Ad-CXXC5组CollaI、CollaIII表达减少,Ad-shRNA-CXXC5组表达增加。与cell组相比,TGF-β1处理组细胞在TGF-β1刺激下CollaI、CollaIII表达均增加。与TGF-β1-Ad-GFP相比,TGF-β1-Ad-shRNA-CXXC5组CXXC5下调协同TGF-β1促进细胞CollaI、CollaIII的表达,而TGF-β1-Ad-CXXC5组CXXC5过表达可减弱TGF-β1的以上作用。研究结论小鼠肺成纤维细胞表达CXXC5。TGF-β1刺激小鼠肺成纤维细胞后,CXXC5表达减少,Wnt/β-catenin信号通路活化。CXXC5过表达抑制成纤维细胞增殖促进其凋亡。CXXC5沉默表达促进成纤维细胞增殖抑制其凋亡。CXXC5过表达通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活化,抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,抑制细胞外基质产生,抑制肺纤维化。CXXC5表达下调促进Wnt/β-catenin信号通路活化,促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,促进细胞外基质产生,促进肺纤维化。
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